Effect of freeze-drying extenders on ram sperm DNA integrity

DNA hasarının belirlenebilmesi, sperma saklama yöntemlerinin geliştirilmesi açısından önemlidir. Biz çalışmamızda farklı liyofilizasyon medyumları kullanılarak saklanan sperm hücrelerinin DNA bütünlüğünün değerlendirilmesinde akridin oranj (AO) ve therminal deoxynucleotidyl transferase-medited dUDP nick and labelling (TUNEL) floresan boyama yöntemlerini kullandık. Koçlardan alınan sperma dört gruba bölündü ve her bir grup: I) %10 fötal buzağı serumu (FCS) içeren TCM 199 solüsyonu II) %10 FCS ve 0,2 mol/L trehaloz içeren TCM 199 solüsyonu III) 50 mmol/L NaCl ve EGTA [Ethylen glycol-bis (β-aminoethyl ether)-N, N, N, N,-tetraacetic acid] 10 mmol/L Tris solüsyonu ve IV) %20 yumurta sarısı ve %7 gliserol içeren Tris bazlı solüsyonlardan biri ile konsantrasyonu 10 x 106 spermatozoa/100 μL olacak şekilde sulandırıldı. Taze alınan spermada DNA fragmentasyon oranı AO ve TUNEL yöntemlerinde sırasıyla %2,0 ±1,2 ve %3,8±3,7 olarak tespit edildi (P>0.05). AO ve TUNEL yöntemiyle değerlendirilen liyofilizasyon sonrası DNA bütünlüğüne sahip spermatozoa oranlarının, sulandırıcı farklılığına göre etkilenmediği tespit edildi (P>0.05). Aynı şekilde her iki boyama yöntemi karşılaştırıldığında, liyofilizasyon sonrası elde edilen DNA bütünlüğünün değerlendirilmesinde AO ve TUNEL sonuçlarının istatistiksel olarak farklı olmadığı belirlendi (P>0.05). Çalışmamızın sonuçları; sulandırıcı gruplarından her birinin koç spermasının liyofilizasyonu için uygun olduğunu ve her iki boyama yönteminin de tercih edilebileceğini göstermektedir.The ability to detect nuclear damage is an important tool for the development of sperm preservation methods. We used the acridine orange (AO) and the therminal deoxynucleotidyl transferase-medited dUDP nick and labelling (TUNEL) assay to evaluation of DNA status of sperm cells preserved with different lyophilization media. Collected ram semen were divided into four groups and diluted to a 10x106 spermatozoa/100μL with one of the extender: I) TCM 199 contained 10% fetal calf serum (FCS), II) TCM 199 contained 10% FCS and 0,2 mol/L trehaloz, III) 10 mmol/L Tris contained 50 mmol/L NaCl and EGTA [Ethylen glycol-bis (β-aminoethyl ether)-N, N, N, N,-tetraacetic acid] and IV) Tris based semen extender contained 20% egg yolk and 7% glycerol and then diluted semen were lyophilized. Freshly collected semen DNA fragmentation rate was 2,0% ±1,2 and 3,8%±3,7 obtained by AO and TUNEL assay, respectively (P>0.05). The DNA integrity of rehydrated spermatozoa as determined by AO and TUNEL assays were not affected by freeze-drying extender (P>0.05). Similar results were obtained by AO and TUNEL assays after rehydration (P>0.05). The results of this study showed that each of the diluent groups is suitable for lyophilization of ram semen and that both staining methods can be preferred

Liyofilizasyon Amaçlı Kullanılan Sulandırıcıların Koç Spermasının DNA Bütünlüğü Üzerine Etkisi

DNA hasarının belirlenebilmesi, sperma saklama yöntemlerinin geliştirilmesi açısından önemlidir. Biz çalışmamızda farklı liyofilizasyon medyumları kullanılarak saklanan sperm hücrelerinin DNA bütünlüğünün değerlendirilmesinde akridin oranj (AO) ve therminal deoxynucleotidyl transferase-medited dUDP nick and labelling (TUNEL) floresan boyama yöntemlerini kullandık. Koçlardan alınan sperma dört gruba bölündü ve her bir grup: I) %10 fötal buzağı serumu (FCS) içeren TCM 199 solüsyonu II) %10 FCS ve 0,2 mol/L trehaloz içeren TCM 199 solüsyonu III) 50 mmol/L NaCl ve EGTA [Ethylen glycol-bis (β-aminoethyl ether)-N, N, N, N,-tetraacetic acid] 10 mmol/L Tris solüsyonu ve IV) %20 yumurta sarısı ve %7 gliserol içeren Tris bazlı solüsyonlardan biri ile konsantrasyonu 10 x 106 spermatozoa/100 μL olacak şekilde sulandırıldı. Taze alınan spermada DNA fragmentasyon oranı AO ve TUNEL yöntemlerinde sırasıyla %2,0 ±1,2 ve %3,8±3,7 olarak tespit edildi (P>0.05). AO ve TUNEL yöntemiyle değerlendirilen liyofilizasyon sonrası DNA bütünlüğüne sahip spermatozoa oranlarının, sulandırıcı farklılığına göre etkilenmediği tespit edildi (P>0.05). Aynı şekilde her iki boyama yöntemi karşılaştırıldığında, liyofilizasyon sonrası elde edilen DNA bütünlüğünün değerlendirilmesinde AO ve TUNEL sonuçlarının istatistiksel olarak farklı olmadığı belirlendi (P>0.05). Çalışmamızın sonuçları; sulandırıcı gruplarından her birinin koç spermasının liyofilizasyonu için uygun olduğunu ve her iki boyama yönteminin de tercih edilebileceğini göstermektedir. Anahtar Kelimeler: koç sperması, liyofilizasyon, DNA bütünlüğü, tunel, akridin oran

Eff ects of Melatonin Addition to the Cold Storage Medium on Cumulus Oocyte Complex Apoptosis, Viability and In Vitro Maturation Rates of Cat Oocytes

Abstract: Usage of oocytes obtained from ovaries aft er long-term cold storage for in vitro embryo production is a promising tool for the protection of wildlife and endangered animal species. Mammalian oocytes are susceptible to oxidative stress with regard to the high lipid content of plasma membranes. Melatonin is known as a powerful antioxidant and anti-apoptotic agent due to its ability to eliminate toxic oxygen derivatives and reduce the formation of reactive species. Th is study was performed to verify the optimal environmental conditions for long-term preservation of cat ovaries (Felis domesticus) by adding diff erent concentrations of melatonin (500, 750 and 1000 µM) to the storage medium (0.9% NaCl) as an antioxidant to be preserved at 4°C for 24 h. To determine the eff ect of melatonin on cat oocytes collected from stored ovaries, the anti and proapoptotic gene levels in cumulus oophorus, the in vitro maturation rates, the cell membrane and oocytes viability were evaluated. In all melatonin added groups regardless of whether they are stored in the cold; Pro-apoptotic gene levels (BAX) were determined to be upregulated however, antiapoptotic gene levels (BCL-2) were downregulated in cumulus cells (P<0.05). Th e cell membrane stability and cell viability rates of oocytes began to deteriorate in parallel with the rate of melatonin increase. In parallel with these findings, in vitro maturation rates of oocytes were negatively aff ected as the amount of melatonin increased (P≤0.001). In conclusion the results showed that adding melatonin (500,750 or 1000 µM) to the ovarian transport and storage medium had negative eff ect on in vitro maturation rate, viability and cell membrane structure of cat oocytes