An Autocatalytic Step in the Reaction Cycle of Hydrogenase from Thiocapsa roseopersicina Can Explain the Special Characteristics of the Enzyme Reaction

AbstractA moving front has been observed as a special pattern during the hydrogenase-catalyzed reaction of hydrogen uptake with benzyl viologen as electron acceptor in a thin-layer reaction chamber. Such fronts start spontaneously and at random times at different points of the reaction chamber; blue spheres are seen expanding at constant speed and amplitude. The number of observable starting points depends on the hydrogenase concentration. Fronts can be initiated by injecting either a small amount of completed reaction mixture or activated hydrogenase, but not by injecting a low concentration of reduced benzyl viologen. These characteristics are consistent with an autocatalytic reaction step in the enzyme reaction. The special characteristics of the hydrogen-uptake reaction in the bulk reaction (a long lag phase, and the enzyme concentration dependence of the lag phase) support the autocatalytic nature. We conclude that there is at least one autocatalytic reaction step in the hydrogenase-catalyzed reaction. The two possible autocatalytic schemes for hydrogenase are prion-type autocatalysis, in which two enzyme forms interact, and product-activation autocatalysis, where a reduced electron acceptor and an inactive enzyme form interact. The experimental results strongly support the occurrence of prion-type autocatalysis

SVD-clustering, a general image-analyzing method explained and demonstrated on model and Raman micro-spectroscopic maps

An image analyzing method (SVD-clustering) is presented. Amplitude vectors of SVD factorization (V1…Vi) were introduced into the imaging of the distribution of the corresponding Ui basis-spectra. Since each Vi vector contains each point of the map, plotting them along the X, Y, Z dimensions of the map reconstructs the spatial distribution of the corresponding Ui basis-spectrum. This gives valuable information about the first, second, etc. higher-order deviations present in the map. We extended SVD with a clustering method, using the significant Vi vectors from the VT matrix as coordinates of image points in a ne-dimensional space (ne is the effective rank of the data matrix). This way every image point had a corresponding coordinate in the ne-dimensional space and formed a point set. Clustering was applied to this point set. SVD-clustering is universal; it is applicable to any measurement where data are recorded as a function of an external parameter (time, space, temperature, concentration, species, etc.). Consequently, our method is not restricted to spectral imaging, it can find application in many different 2D and 3D image analyses. Using SVD-clustering, we have shown on models the theoretical possibilities and limitations of the method, especially in the context of creating, meaning/interpreting of cluster spectra. Then for real-world samples, two examples are presented, where we were able to reveal minute alterations in the samples (changing cation ratios in minerals, differently structured cellulose domains in plant root) with spatial resolution. © 2020, The Author(s)

Speciális fizikai módszerek kidolgozása és alkalmazása interdiszciplináris kutatási problémákra = Development and application of special physical methods for interdisciplinary research problems

A KFKI RMKI 5 MV-os Van de Graff gyorsítójánál újra felépítettük, működésbe hoztuk és több ponton továbbfejlesztettük a Hamburg proton mikroszondát, lényegében elérve a korábbi térbeli felbontást (1.2 x 2.4 micro m2 nyalábméret, 500 pA proton áram), de a hamburgi 2 MeV proton energia helyett a nagyobb hatékonyságot biztosító 2.5 MeV proton energián működtetve is. Első alkalmazásokként előzetes mikroPIXE méréseket végeztünk savas esőnek kitett beton korróziós profiljának, valamint éves növekményt mutató hal hallócsont (otolit) metszetek elemeloszlásának meghatározására. Sikeresen adaptáltuk a mikroszondára a korábban milli-nyalábra kidolgozott PIXE-PAGE módszerünket, melytől további fontos eredményeket várunk a fémtartalmú fehérjemolekulák kutatásában. A kulturális örökség megóvását elősegítendő hordozható radioizotóp gerjesztésű XRF berendezést építettünk, mellyel a műtárgyak roncsolásmentes analízise akár in situ is elvégezhető. Módszereket dolgoztunk ki a festékrétegekben kis emnnyiségben jelenlévő Ti kimutatására, melynek fontosságá az adja meg,hogy a titánfehér előfordulása fontos érv vitatott festmények eredetiségének eldöntésében. Hatékony számítási módszert dolgoztunk ki a vastag XRF és PIXE mintákban fellépő belső gerjesztés hatásának figyelembevételére. Hiánypótló méresekkel abszolút gamma sugárzás hozamokat határoztunk meg 10 és 15 MeV energiájú alfa részecskékkel bombázva vastag Ti, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu és Zn céltárgyakat. | The gifted former Hamburg proton microprobe was successfully reinstalled at the 5 MV accelerator of the KFKI RMKI and several improvements were also made. Practically the same spatial resolution was achieved (1.2 x 2.4 micro m2 beam spot, 500 pA proton current), as they did in Hamburg, but using more effective 2.5 MeV energy protons. As first application, microPIXE elemental mappings were carried out to determine the corrosion profile of concrete pieces exposed to acidic rains. Fish otolith sections revealing annual growth was also mapped. Our PIXE-PAGE method developed by using millimeter sized proton beams was succesfully adapted to the microprobe. Further important results in the study metalloproteins are expected from this adaptation. In connection with the preservation of the cultural heritage a small portable XRF spectrometer of radioisotope excitation was built. This instrument is well suited to perform non-destructive in situ analysis of art and archaeological objects Methods were also developed for XRF detection of small amounts of Ti in paint layers. The importance of this effort is given by the fact that the presence of titanium white in a debated paintig could provide important arguments against its originality. A fast computing method was developed to take into account the internal excitation effect in the quantitative evaluation of thick sample XRF and PIXE measurements. Alpha particle induced thick target gamma yields of potential analytical use were measured for Ti, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu és Zn targets. At the 10 and 15 MeV alpha energies we used no reilable data were available in the literature

A fehérjemátrix szerepe a redoxfehérjék működésében = Role of the protein matrix in the function of redox proteins

Rekombináns citokróm c mutánsokat állítottunk elő és a bevezetett ciszteineket TUPS fotoaktív redox jelölővel jelöltük. Ugyancsak jelöltünk felszíni lizineket. Lézerimpulzussal való gerjesztés után kinetikus spektroszkópiai módszerrel mértük és értelmeztük az elektrontranszfer sebességét a jelölő és a citokróm hem kofaktora között. Megállapítottuk, hogy a jelölő flexibilis kovalens kapcsolata miatt több pozíciót tud felvenni és ezért az elektrontranszfer több exponenciálisból álló kinetikát mutat. A kísérleti adatokat összehasonlítottuk modellszámításokkal és megállapítottuk, hogy mind a konkrét elektrontranszfer útvonalakkal, mind pedig a fehérjével, mint változó sűrűségű folytonos közeggel számoló modell az eredményekkel jól megegyező sebességeket jósol. A citokróm felszínét feltérképeztük elektrontranszfer hatékonyság szempontjából: a hem síkjához viszonyított poláros régiók valamivel hatékonyabbak az egyenlítői régióknál. A citokróm c és a citokróm oxidáz komplexében mérve az elektrontranszfert az eddigieknél nagyobb időfelbontással tudtuk megmérni a CuA (első) elektronakceptor redukciójának idejét, és azt 100 ns-nál gyorsabbnak találtuk. Megállapítottuk, hogy E. coli baktériumban érett holocitokróm c kis mennyiségben spontán módon, hem liáz segítsége nélkül is képződik. Sikerült a hem liáz fehérjét heterológ módon kifejezni és tisztítani, és így apocitokróm és hem felhasználásával in vitro holocitokrómot termelni. | We produced recombinant mutant cytochrome c proteins and labeled the introduced cysteines and native lysines with the photoactive redox label TUPS. Pulse laser excitation of TUPS and the ensuing electron transfer between the label and the heme of cytochrome c was followed by kinetic absorption spectroscopy. Due to the flexible covalent link between the label and the protein TUPS can assume multiple positions which result in multiexponential electron transfer kinetics. We compared the experimental data with model calculations and concluded that both the model assuming explicite electron transfer pathways and the model assuming a protein matrix with varying packing density can satisfactorily describe the experimental observations. We mapped the surface of cytochrome c in terms of electron transfer efficiency towards the heme. The polar regions were found to be slightly more efficient ('hotter') than the equatorial regions relative to the plane of the heme. By measuring the electron transfer in the complex of cytochrome c and cytochrome c oxidase at a higher time resolution than in previous studies, we obtained a reduction time of the primary electron acceptor, CuA, which is faster than 100 ns. We found that in E. coli a low efficiency spontaneous maturation of holocytochrome c can take place without the assistance of heme lyase. We expressed and purified yeast heme lyase from E. coli and demonstrated in vitro holocytochrome maturation upon addition of apocytochrome and heme

SVD-clustering, a general image-analyzing method explained and demonstrated on model and Raman micro-spectroscopic maps

An image analyzing method (SVD-clustering) is presented. Amplitude vectors of SVD factorization (V1…Vi) were introduced into the imaging of the distribution of the corresponding Ui basis-spectra. Since each Vi vector contains each point of the map, plotting them along the X, Y, Z dimensions of the map reconstructs the spatial distribution of the corresponding Ui basis-spectrum. This gives valuable information about the first, second, etc. higher-order deviations present in the map. We extended SVD with a clustering method, using the significant Vi vectors from the VT matrix as coordinates of image points in a ne-dimensional space (ne is the effective rank of the data matrix). This way every image point had a corresponding coordinate in the ne-dimensional space and formed a point set. Clustering was applied to this point set. SVD-clustering is universal; it is applicable to any measurement where data are recorded as a function of an external parameter (time, space, temperature, concentration, species, etc.). Consequently, our method is not restricted to spectral imaging, it can find application in many different 2D and 3D image analyses. Using SVD-clustering, we have shown on models the theoretical possibilities and limitations of the method, especially in the context of creating, meaning/interpreting of cluster spectra. Then for real-world samples, two examples are presented, where we were able to reveal minute alterations in the samples (changing cation ratios in minerals, differently structured cellulose domains in plant root) with spatial resolution. © 2020, The Author(s)

A hidrogenáz autokatalitikus enzimreakciójának tanulmányozása = Investigation of the autocatalytic enzyme reaction of hydrogenase

Kimutattuk, hogy a hidrogenáz enzimreakcióban legalább egy autokatalitikus lépés található, az autokatalizátor egy enzim forma mely egy másik enzimformával hat kölcsön. Az autokatalizátor kölcsönhat az oxidált elektron akceptorral is tehát egy olyan enzimforma, melynek a disztális vas-kén kockája redukált állapotban van. Elméleti modellt fejlesztettük, mely mindezeket a kísérleti jelenségeket megmagyarázza. Kimutattuk, hogy a Hofmeister sók hatással vannak a hidrogenáz enzimreakcióra. Kozmotropikus sók a reakciót nem befolyásolják, nagy koncentrációjú kaotropikus sók igen. CD méréseket végeztünk hidrogenázokon és citokróm c4-en, hogy a hőmérséklet és sók hatására bekövetkező szerkezetváltozásokat vizsgáljuk. A citokróm c4 fehérjét sikeresen kristályosítottuk. Kimutattuk, hogy szubsztrát limitált körülmények között a hidrogenáz reakció oszcillál. Kísérleti eredményeinkből 6 publikáció született. Ezek összesített impakt faktora 21.86. 9 nemzetközi és 3 hazai konferencián tartottunk előadást. A pályázat három PhD dolgozatot eredményezett. Ősz Judit 2005-ben, Rui Miguel Mamede Branca 2008-ban, Pankotai-Bodó Gabriella pedig 2009-ben szerzett PhD fokozatot. | We have demonstrated that the hydrogenase enzyme reaction incorporates at least one autocatalytic step. The autocatalyst is an enzyme form and during the autocatalytic reaction it interacts with another enzyme form. The autocatalyst interacts with the oxidized electron acceptor as well, acordingly it is an enzyme form where the distal FeS cluster is reduced. We have developed an enzyme kinetic model to explain the observed characteristics. The salts from Hofmeister series do also affect the hydrogenase reaction. Kozmotropic salts have no effect while chaotropic salts change the kinetic characteristics. We have performed CD experiments in order to investigate how the temperature and the Hofmeister salts induce structural changes on hydrogenase and cytochrome c4. We have successfully crystallized the cytochrome c4 protein. We have discovered that under substrate limited conditions the hydrogenase displays oscillatory behaviour. We have published six papers in international journals, the sum of their impacts is 21.86. We have contributed on nine international and three national conferences. The grant resulted three PhD thesises. Judit Ősz has got the PhD in 2005, Rui Mamede Branca in 2008 and Gabriella Pankotai-Bodó in 2009

A foszfatidilglicerol szerepe fotoszintetikus membránok szerkezetének kialakításában = The essential role of phosphatidylglycerol in the formation of photosynthetic membrane structure

A negatív töltéssel rendelkező lipidek közül a foszfatidilglicerol (PG) jelentős szerepet tölt be. 1. Létrehoztuk egy FG szintézisben gátolt Synechocytis PCC6803 mutánst melyben megnéztük a CP43 kapcsolódását a kettes fotokémiai rendszer reakció centrumához. Ezt a mutánst egy, a fénybegyűjtő rendszer nélküli mutánssal hoztuk létre, a cdsA gén inaktiválásával. Megállapítottuk, hogy az FG kiürülés hatására a CP43 fehérje bekötődése gátolt. Megállapítottuk, hogy az FG kiürülés csökkenti a cianobaktérium sejtek oxigénfejlesztő képességét. 2. Megállapítottuk, hogy az FG kiürülés megváltoztatja a fotoszintetikus membrán felszíni töltését. 3. Az FG molekulák hatására bekövetkező fotoszintetikus aktivitást a reakció centrumok megváltozása okozza. A reakció centrumok fényérzékennyé vállnak. Ez ellen a sejtek megnövekedett karotin tartalommal védekeznek. A myxoxantin és az echinenon mennyisége nő meg. 4. A Syenechococcus PCC PCC7942 cdsA mutáns létrehozásával igazoltuk, hogy az FG molekulák szerepe a fotoszintetikus szervezetekben általánosítható. Megállapítottuk, hogy az FG kiürülés a különböző törzseken különböző mértékben hat. 5 Az FG molekulák kiürülésének hatására bekövetkező stressz elleni protekció a karotinoid molekulák megjelenése fotoszintetikus reakció centrumokbanmellett megfigyeltük azt is, hogy az FG molekulák zsírsav összetétele megváltozik. A molekulák átalakulását tömegspektometriásan igazoltuk. Az eredményeinket egy áttekintő cikkünkben foglaltuk össze. | Among the negatively charged lipids phosphatidylglycerol (PG) plays an important role. We used transformable cyanobacterial strains.1n We used a Phycobilisome-less mutant of Synechocytis PCC6803 was transformed with inactivated cdsA and the synthesis of PG was blocked. Binding of CP43 to the reaction center complex was investigated. The oxygen evolving activity of mutant was reduced. 2. The PG-depletion affected the surface charge of membranes. 3. PG-depletion induced sensitivity of cells which was compensated by elevated carotenoid content, mainly myxoxanthophyll and echinenone. 4. We generated Syenechococcus PCC PCC7942 cdsA mutant with which we could generalize the importance of PG in photosynthetic organizms. However, we could observe slight differencein different mutant. 5. Westudied PG remodeling by mas spectrometry

The autocatalytic step is an integral part of the hydrogenase cycle

We earlier proved the involvement of an autocatalytic step in the oxidation of H2 by HynSL hydrogenase from Thiocapsa roseopersicina, and demonstrated that two enzyme forms interact in this step. Using a modified thin-layer reaction chamber which permits quantitative analysis of the concentration of the reaction product (reduced benzyl viologen) in the reaction volume during the oxidation of H2, we now show that the steady-state concentration of the product displays a strong enzyme concentration dependence. This experimental fact can be explained only if the previously detected autocatalytic step occurs inside the catalytic enzyme-cycle and not in the enzyme activation process. Consequently, both interacting enzyme forms should participate in the catalytic cycle of the enzyme. As far as we are aware, this is the first experimental observation of such a phenomenon resulting in an apparent inhibition of the enzyme. It is additionally concluded that the interaction of the two enzyme forms should result in a conformational change in the enzyme–substrate form. This scheme is very similar to that of prion reactions. Since merely a few molecules are involved at some point of the reaction, this process is entirely stochastic in nature. We have therefore developed a stochastic calculation method, calculations with which lent support to the conclusion drawn from the experiment. © 2013 Elsevier B.V. All rights reserved

Concentration-Dependent Front Velocity of the Autocatalytic Hydrogenase Reaction

HynSL hydrogenase from Thiocapsa roseopersicina was applied to catalyze the oxidation of molecular hydrogen in a new, improved, thin-layer reaction chamber. Investigation of the nature of this catalysis via the development of reduced benzyl viologen showed clearly the typical characteristics of an autocatalytic reaction: propagation of a reaction front originating from a single point, with a constant velocity of front propagation. The dependence of the reaction velocity on enzyme concentration was a power function with a positive enzyme concentration threshold, with an exponent of 0.4 ± 0.05. This indicates that the autocatalyst is an enzyme form. The front velocity decreased on increase of the electron acceptor concentration, as a sign that the autocatalyst interacts directly with the final electron acceptor. Overall, it may be concluded that the autocatalyst is an enzyme form in which [FeS]distal is reduced. Model calculations corroborate this. Because the reduction of all [FeS] clusters would be possible in a nonautocatalytic reaction, we hypothesize a small conformational change in the enzyme, catalyzed by the autocatalyst, which removes a block in the electron flow in either [NiFe] → [FeS]proximal or the [FeS]proximal → [FeS]distal reaction step, or removes a block of the penetration of gaseous hydrogen from the surface to the [NiFe] cluster