Autofagia en el estrés e interacciones con la fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC): efecto de las modificaciones postraduccionales de la proteína sobre su estabilidad y su reclutamiento a la vía autofágica

La fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC; EC 4.1.1.31) es una enzima citosólica multifuncional que está implicada en procesos clave del metabolismo del carbono y del nitrógeno. Esta enzima está regulada por distintas modificaciones postraduccionales (PTMs), las cuales modifican la enzima y modulan su actividad de forma compleja. En cuanto a su degradación, una fracción de la cantidad total de PEPC se degrada por el sistema ubiquitina-proteasoma, pero no se ha descrito una ruta alternativa de degradación ni mecanismos de regulación de la misma. Este trabajo profundiza en los elementos reguladores de la estabilidad de la PEPC C4 fotosintética de sorgo, así como de las isoformas C3 de la misma. Para ello, se ha analizado la repercusión de las PTMs sobre la estabilidad de la proteína, y se ha estudiado el papel de la autofagia, selectiva y masiva, en la degradación de la PEPC. Numerosas evidencias experimentales muestran que existe una interacción entre la oxidación proteica, derivada de las especies reactivas de oxígeno (ROS), y la S-nitrosilación de proteínas, derivada del óxido nítrico (NO). Previamente se había descrito que el NO incrementaba la actividad de la fosfoenolpiruvato carboxilasa quinasa (PEPCK) en hojas de sorgo, fomentando la fosforilación de la PEPC fotosintética. En este trabajo, se ha encontrado en hojas de sorgo una interacción, in vitro e in vivo, entre la carbonilación de la PEPC C4, que la inactivaba, y la S-nitrosilación de la misma, que aumentaba la resistencia a la posterior carbonilación y, por tanto, preservaba su actividad. Además, en plantas sometidas a un choque salino, la carbonilación de la PEPC aumentó a la vez que la S-nitrosilación disminuyó. A continuación, se detectó un aumento de la S-nitrosilación de la PEPC acompañado de un descenso en la carbonilación. Estos resultados sugieren que la S-nitrosilación puede contribuir a mantener la actividad de la PEPC C4 en hojas de sorgo estresadas por sal. De este modo, la síntesis de NO inducida por la salinidad protegería a la PEPC fotosintética de la inactivación oxidativa. Al mismo tiempo, al promover su fosforilación, garantizaría el funcionamiento óptimo de la enzima en condiciones subóptimas. En plantas C3 existen varias rutas de degradación de componentes cloroplastídicos en la vacuola. Algunas de estas rutas están relacionadas con la autofagia y otras no. En ellas, la rubisco y otras proteínas son incluidas en vesículas que posteriormente se transportan a la vacuola y se degradan para reciclar el nitrógeno. Por otro lado, el ácido fosfatídico (PA) provoca la exposición del extremo C-terminal de la PEPC de tipo C4, reconocido por una proteasa. Cuando el PA se une a la proteína, induce el reclutamiento de ésta a membrana, acompañado de su inactivación. En maíz, la PEPC de tipo C4 se une a la membrana del cloroplasto al mismo tiempo que pierde su actividad. Esto sugiere que en plantas C4 la PEPC puede estar relacionada con las vías de degradación vacuolar de componentes del cloroplasto, ya que, al igual que la rubisco, constituye una fuente importante para el reciclaje de nitrógeno. La autofagia es un proceso muy conservado que se encarga de la degradación, masiva o selectiva, de componentes celulares a través de su encapsulación en vesículas de doble membrana, denominadas autofagosomas, y posterior degradación en la vacuola. La autofagia, al igual que la PEPC, tiene un papel principal en el metabolismo del carbono y el nitrógeno. Además, esta vía se activa en respuesta a la deficiencia de estos dos elementos. Como la actividad PEPC está estrictamente controlada postraduccionalmente, es probable que su degradación también se encuentre muy regulada. La autofagia selectiva constituye una vía de degradación precisa y controlada, y su regulación es dirigida por receptores de cargo como NBR1, cuyo principal sustrato de reconocimiento es la ubiquitina. La PEPC es monoubiquitinada in vivo, pero su función fisiológica aún no está clara. Esta PTM aumenta en raíces estresadas por amonio y en semillas en germinación, y éstos son procesos en los que la autofagia está implicada. En este trabajo, en primer lugar, se han desarrollado métodos para la detección y el estudio de la autofagia en sorgo; y, en segundo lugar, se ha investigado la degradación autofágica de la PEPC y su relación con la monoubiquitinación de la proteína de tipo C3. En sorgo, la autofagia se activó en condiciones de estrés salino, nutricional y oxidativo, y la visualización de autofagosomas mediante microscopía confocal y electrónica constituyó un método efectivo para monitorizarla. Las medidas de expresión de los genes SbATG18a, SbATG6a y SbATG6b permitieron detectar la activación de la autofagia en condiciones de estrés oxidativo y estrés nutricional por deficiencia de carbono y fósforo, pero no por deficiencia de nitrógeno y hierro. El desarrollo de estos métodos abre la puerta al estudio de procesos relacionados con la autofagia en sorgo. Por el contrario, se encontró que la proteína vírica βC1 mostró interacciones inespecíficas que hacen que no sea una herramienta idónea para estudios de autofagia. Además, el péptido que contiene el dominio de unión a ATG8 de βC1 no interaccionó in vitro con la proteína ATG8a de arabidopsis, presumiblemente por requerir algún elemento adicional, como la fosforilación, para ello. Por lo tanto, tampoco es una herramienta útil para la detección de autofagosomas in vivo. Diversos resultados experimentales demostraron que una fracción de la proteína PEPC se procesa por la vía autofágica. Por un lado, se observó una disminución de la cantidad de PEPC en raíces de sorgo con déficit de nitrógeno y en células de Nicotiana benthamiana con déficit de carbono, condiciones en las que se activa la autofagia. El uso de inhibidores de la autofagia en estas condiciones bloqueó dicha degradación. Además, en líneas SALK de arabidopsis deficientes en proteínas autofágicas (líneas atg2 y atg5) se observó un aumento de la cantidad total de PEPC. Estos resultados sugieren que una parte del total de proteína PEPC es degradada por autofagia, siendo la primera ocasión en que se observa este tipo de degradación para la PEPC. En cuanto a la monoubiquitinación de la PEPC, disminuyó tras el uso de un activador de la autofagia, la trehalosa, en plantas de arabidopsis, y aumentó en plantas de arabidopsis atg2 y atg5. En células de N. benthamiana, donde la PEPC se encuentra principalmente desubiquitinada, el uso del 3-MA (inhibidor de la formación de autofagosomas) provocó un aumento significativo de esta PTM. Estos resultados sugieren que la monoubiquitinación de la PEPC sirve como marcaje para su degradación por autofagia, lo que constituiría la primera función descubierta para la monoubiquitinación de la PEPC que la relaciona con una ruta de señalización, en este caso degradativa. Por otro lado, la proteína NBR1, un receptor de cargo que participa en la autofagia, se unió a la PEPC en hojas de sorgo, en plantas de arabidopsis atg5, y en células de N. benthamiana en las que la autofagia se había inhibido con 3-MA. Además, NBR1 también interaccionó con una PEPC parcialmente degrada en hojas, raíces y semillas de sorgo, hojas y raíces de arabidopsis y células de N. benthamiana. Estos resultados implican a NBR1 como elemento conector entre la PEPC y la vía autofágica. Los resultados expuestos en este trabajo ponen de manifiesto una implicación de la S-nitrosilación en mantener la estabilidad de la PEPC de tipo C4 de hojas de sorgo, así como evidencian la degradación de la PEPC de tipo C3 vía autofagia. De forma similar, la PEPC C4 también podría degradarse por autofagia, aunque en este caso, la proteína no se monoubiquitina. Futuros experimentos podrán determinar si la interacción con el PA y el reclutamiento a membrana están relacionados con la inclusión de la proteína en vesículas de degradación vacuolar, al igual que la rubisco, para reciclar el nitrógeno

Phosphoenolpyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxylase kinase isoenzymes play an important role in the filling and quality of Arabidopsis thaliana seed

Three plant-type phosphoenolpyruvate carboxylase (PPC1 to PPC3) and two phosphoenolpyruvate carboxylase kinase (PPCKs: PPCK1 and 2) genes are present in the Arabidopsis thaliana genome. In seeds, all PPC genes were found to be expressed. Examination of individual ppc mutants showed little reduction of PEPC protein and global activity, with the notable exception of PPC2 which represent the most abundant PEPC in dry seeds. Ppc mutants exhibited moderately lower seed parameters (weight, area, yield, germination kinetics) than wild type. In contrast, ppck1-had much altered (decreased) yield. At the molecular level, ppc3-was found to be significantly deficient in global seed nitrogen (nitrate, amino-acids, and soluble protein pools). Also, N-deficiency was much more marked in ppck1-, which exhibited a tremendous loss of 95% and 90% in nitrate and proteins, respectively. The line ppck2-had accumulated amino-acids but lower levels of soluble proteins. Regarding carboxylic acid pools, Krebs cycle intermediates were found to be diminished in all mutants; this was accompanied by a consistent decrease in ATP. Lipids were stable in ppc mutants, however ppck1-seeds accumulated more lipids while ppck2-seeds showed high level of polyunsaturated fatty acid oleic and linolenic (omega 3). Altogether, the results indicate that the complete PEPC and PPCK family are needed for normal C/N metabolism ratio, growth, development, yield and quality of the seed.Ministerio de Economía y Competitividad AGL2012-35708, AGL2016-75413-PJunta de Andalucía P12-FQM-48

Genetic and Pharmacological Inhibition of Autophagy Increases the Monoubiquitination of Non-Photosynthetic Phosphoenolpyruvate Carboxylase

Phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) is an enzyme with key roles in carbon and nitrogen metabolisms. The mechanisms that control enzyme stability and turnover are not well known. This paper investigates the degradation of PEPC via selective autophagy, including the role of the monoubiquitination of the enzyme in this process. In Arabidopsis, the genetic inhibition of autophagy increases the amount of monoubiquitinated PEPC in the atg2, atg5, and atg18a lines. The same is observed in nbr1, which is deficient in a protein that recruits monoubiquitinated substrates for selective autophagy. In cultured tobacco cells, the chemical inhibition of the degradation of autophagic substrates increases the quantity of PEPC proteins. When the formation of the autophagosome is blocked with 3-methyladenine (3-MA), monoubiquitinated PEPC accumulates as a result. Finally, pull-down experiments with a truncated version of NBR1 demonstrate the recovery of intact and/or fragmented PEPC in Arabidopsis leaves and roots, as well as cultured tobacco cells. Taken together, the results show that a fraction of PEPC is cleaved via selective autophagy and that the monoubiquitination of the enzyme has a role in its recruitment towards this pathway. Although autophagy seems to be a minor pathway, the results presented here increase the knowledge about the role of monoubiquitination and the regulation of PEPC degradation.España, Junta de Andalucía (P12-FQM-489 and PAI group BIO298)España Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2012-35708 and AGL2016-75413-P

Neandertales y Humanos modernos en Guadalajara

Con autorización de la revista para autores CSIC[EN] We present partial results obtained in an interdisciplinary research project focused on the human settlement of the Guadalajara province (Spain) during the Middle and Upper Palaeolithic. The excavation of the Peña Capón, Peña Cabra and Los Casares sites have shown outstanding evidence for investigating population dynamics and human-environment interactions in the interior territories of the Iberian Peninsula during the Late Pleistocene. Traditionally depicted as marginal and lacking own cultural developments, these territories have provided scarce and weak data for the Middle and –especially– Upper Paleolithic, and thus the proposed interpretations on the mentioned problems have been always flawed. However, our results enable us to confirm the cultural relevance of the region under study during Upper Pleniglacial times previously considered devoid of human occupation. Also, we are now able to contribute with solid data from inland Spain to the problem of the Neandertal demise in the Iberian Peninsula and southwest Europe.[ES] Presentamos parte de los resultados de un proyecto de investigación interdisciplinar sobre el poblamiento humano en la provincia de Guadalajara durante el Paleolítico Medio y el Superior. Basados en la excavación de los yacimientos de Peña Capón, Peña Cabra y Los Casares, los datos obtenidos presentan importantes implicaciones para la investigación de las dinámicas poblaciones y la relación entre ocupación humana y variabilidad climática y ambiental en el interior de la península ibérica durante el Pleistoceno Superior. Tradicionalmente consideradas marginales, las regiones interiores peninsulares han aportado escasas evidencias relevantes para estas cronologías, provocando así que las interpretaciones sobre los problemas aludidos sean altamente cuestionables. Sin embargo, los resultados obtenidos nos permiten afirmar la entidad cultural de la región estudiada durante momentos del Pleniglacial Superior antes considerados deshabitados, así como contribuir con evidencias sólidas a la controversia del final de los Neandertales en la península ibérica.Gran parte de las investigaciones han sido financiadas a través de un proyecto Marie Curie (IEF) dentro del Séptimo Programa Marco (FP7) de la Comisión Europea (Identificador: 628179) así como por la Fundación Alemana de Investigación (DFG) bajo el CRC 806 “Our Way to Europe”. También se ha contado con financiación proveniente de los siguientes proyectos del Ministerio de Economía y Competitividad financiados por la Agencia Estatal de Investigación (AEI) y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER): HAR2013-48784-C3-3-P, HAR2016-76760-C3-2-P, HAR2013-43701-P, CGL2012-38434-C03-01 y HAR2017-82483-C3-3-P. Manuel Alcaraz-Castaño disfruta de un contrato co-financiado por las Ayudas para la Atracción de Talento Investigador de la Comunidad de Madrid (referencia 2016-T2/HUM-1251)