Biomarker-based phenotyping of myocardial fibrosis identifies patients with heart failure with preserved ejection fraction resistant to the beneficial effects of spironolactone: results from the Aldo-DHF trial

Background: Myocardial fibrosis is characterized by excessive cross‐linking and deposition of collagen type I and is involved in left ventricular stiffening and left ventricular diastolic dysfunction (LVDD). We investigated whether the effect of spironolactone on LVDD in patients with heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) depends on its effects on collagen cross‐linking and/or deposition. Methods and results: We investigated 381 HFpEF patients from the multicentre, randomized, placebo‐controlled Aldo‐DHF trial with measures of the E:e' ratio. The ratio of serum carboxy‐terminal telopeptide of collagen type I to serum matrix metalloproteinase‐1 (CITP:MMP‐1, an inverse index of myocardial collagen cross‐linking) and serum carboxy‐terminal propeptide of procollagen type I (PICP, a direct index of myocardial collagen deposition) were determined at baseline and after 1‐year treatment with spironolactone 25 mg once daily or placebo. Patients were classified by CITP:MMP‐1 and PICP tertiles at baseline. While CITP:MMP‐1 tertiles at baseline interacted (P < 0.05) with spironolactone effect on E:e', PICP tertiles did not. In fact, while spironolactone treatment did not modify E:e' in patients with lower CITP:MMP‐1 levels, this ratio was significantly reduced in the remaining spironolactone‐treated patients. In addition, PICP was unchanged in patients with lower CITP:MMP‐1 levels but was reduced in the remaining spironolactone‐treated patients. Conclusions: A biochemical phenotype of high collagen cross‐linking identifies HFpEF patients resistant to the beneficial effects of spironolactone on LVDD. It is suggested that excessive collagen cross‐linking, which stabilizes collagen type I fibres, diminishes the ability of spironolactone to reduce collagen deposition in these patients

Characterization of the synergistic effect of saponins and protein toxins

Zielgerichtete Wirkstoffe in der Tumortherapie verbessern die spezifische Eliminierung von Tumorzellen und verringern gleichzeitig Nebenwirkungen. Zervixkarzinome stellen die zweithäufigste Krebserkrankung bei Frauen dar und bei 90% der Tumoren wurde eine Überexpression des epidermal growth factor receptor (EGFR) nachgewiesen. Aus diesem Grund wurde die Wirkung des zielgerichteten Toxins SE auf Zervixkarzinomzellen eingehend charakterisiert. SE ist ein Fusionsprotein aus dem pflanzlichen Proteintoxin Saporin und dem humanen epidermal growth factor, dem Liganden des EGFR. Zusätzlich wurde die toxizitätssteigernde Wirkung des Saponingemischs Saponinum album (Spn) aus Gypsophila paniculata untersucht. SE führte auf fast allen untersuchten Zervixkarzinomzellen zu einer starken Wachstumsinhibition, die zusätzlich durch Spn enorm gesteigert werden konnte (bis zu 76.000fach). Da sowohl SE als auch Spn in den eingesetzten Konzentrationen alleine nicht toxisch waren, liegt ein eindeutig synergistischer Effekt vor. Weiterhin ist der nachgewiesene Effekt rezeptorspezifisch, wie mit Hilfe von Saporin ohne den Liganden sowie der linearen Korrelation zwischen der EGFR-Expression und der SE-Wirkung nachgewiesen werden konnte. Das Vorhandensein des EGFR ist eine Voraussetzung für die verstärkende Wirkung von Spn, diese beruht jedoch nicht auf einer erhöhten Expression des EGFR durch Spn. Es lag keine lineare Korrelation zwischen der EGFR-Expression und der Wirkung von SE in Kombination mit Spn vor. Zur Untersuchung des Wirkmechanismus von Spn wurde die Aufnahme von SE charakterisiert. Interessanterweise konnten in Inhibitionsstudien deutliche Unterschiede in der Aufnahme von SE in Abhängigkeit von Spn nachgewiesen werden. In Abwesenheit von Spn erfolgt die SE-Aufnahme unabhängig von Clathrin, Aktin und der Ansäuerung der Endosomen. In Anwesenheit von Spn sind diese Proteine und Mechanismen jedoch essentiell für die toxische Wirkung von SE. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass Spn keinen Einfluss auf retrograd transportierte Toxine ausübt. Daher ist es unwahrscheinlich, dass Spn auf diesem Weg die Wirkung von SE verstärkt. Für einen Einsatz von Tumortherapeutika ist es von großer Bedeutung wie die behandelten Zellen absterben, da die Aktivierung der Nekrose zu starken Nebenwirkungen führen kann. Für die Behandlung mit SE konnten typisch apoptotische Prozesse nachgewiesen werden (Spaltung der Poly-ADP-Ribose-Polymerase 1, DNA- Fragmentierung, Beteiligung proapoptotischer Proteine). Interessanterweise erfolgte der Zelltod unabhängig von der Caspase 3. Nekrotische Prozesse konnten eindeutig ausgeschlossen werden. Schon leichte Veränderungen in der Zusammensetzung des Saponingemischs könnten einen Therapieerfolg beeinflussen. Aus diesem Grund wurden verschiedene isolierte Saponine untersucht und für zwei Saponine hervorragende Eigenschaften bei der Verstärkung der Cytotoxizität von SE nachgewiesen. Für die Wirkung der Saponine sind verschiedene strukturelle Eigenschaften von besonderer Bedeutung. Die Aufklärung dieser relevanten Strukturen ist für den Einsatz in der Tumortherapie von besonderer Bedeutung. Die vorgestellten Arbeiten konnten das Verständnis für den molekularen Mechanismus der verstärkenden Wirkung von Spn wesentlich verbessern. Durch die sehr erfolgreiche Analyse der isolierten Saponine stehen nun geeignete Methoden für präklinische Studien zur Verfügung.The use of monoclonal antibodies and targeted toxins significantly improves the specific elimination of cancer cells and therefore decreases side effects. Cervical cancer is the second most common cancer in women. The epidermal growth factor receptor (EGFR) is overexpressed in 90% of the cervical carcinomas. Therefore the impact of the targeted toxin SE on human cervical carcinoma cell lines was studied in detail. SE consists of the plant protein toxin saporin and the human epidermal growth factor, the ligand of EGFR. Preceding studies revealed a strong enhancement of the cytotoxicity of SE by the saponin composite Saponinum album (Spn) from Gypsophila paniculata. The treatment with SE resulted in a strong growth inhibition on nearly all of the tested cervical carcinoma cell lines and was dramatically enhanced by the combined application of Spn (up to 76 000-fold). This effect is clearly synergistic; both SE and Spn alone are non-toxic at the applied concentrations. Since the protein toxin saporin is scarcely cytotoxic, the demonstrated effect is clearly dependent on EGFR. This was confirmed by a clear correlation between the expression level of EGFR and the impact of SE. Spn by itself does not increase the expression of EGFR and therefore the enhancing property of Spn is independent of the EGFR expression level. However, if the EGFR is expressed at all Spn mediates a stronger enhancement. Inhibition studies were performed to analyze the enhancing property of Spn. Interestingly, a clear difference in the uptake of SE in presence or absence of Spn was found. The uptake of SE occurs independently of the presence of clathrin and actin and no acidification of the endosomes is necessary. Upon combination with Spn, SE is delivered by other mechanisms, requiring clathrin, actin and an acidification of the endosomes. Additionally, it was clearly excluded that Spn has an influence on retrograd transported toxins. It is therefore unlikely that Spn enhances the toxicity of SE via this mechanism. To date, it was not known which cell death mechanism is activated by SE. This knowledge, however, would be relevant for the use of SE in therapies, since the activation of necrosis will cause strong side effects. The treatment with SE resulted in apoptotic processes, demonstrated by the cleavage of Poly-ADP- Ribose-Polymerase 1, DNA-fragmentation and involvement of proapoptotic proteins. Interestingly, cell death was independent of caspase 3 activation. Necrotic processes were excluded due to the absence of the typical loss of membrane integrity. The use of a saponin composite in tumor therapies is not advisible, because slight changes in composition may have a large impact on the success of the therapy. Therefore, purified saponins were studied and two different saponins revealed excellent enhancing properties on the cytotoxicity of SE. Structural properties are very important for the function of saponins and the clarification of the relevant structures for the enhancing property of saponins is of utmost importance for their application in therapies. This study on the mechanism of action of the targeted toxin SE and the combination of SE and Spn considerably contributes to the understanding of the molecular mechanism that is mainly based on the enhancement caused by Spn. The successful analysis of the isolated saponins offers promising data for preclinical studies