Charakterisierung der E179K-Variante des Transient Receptor Potential Ankyrin 1 Proteins in vitro

Der TRPA1-Kanal gehört zur Familie der transient receptor potential-Kanäle (TRPs) und wird nach heutigem Wissensstand der Untergruppe der thermosensitiven TRP-Kanäle zugeordnet. Er wird bevorzugt im Nervensystem exprimiert, wo er hauptsächlich die Aufgabe eines Kälterezeptors, insbesondere für schmerzhafte Kälte erfüllt. Eine Transition von Guanin zu Adenin an Position 710 der TRPA1 DNA (710G>A) führt zu einer Aminosäuresubstitution von Glutamat (E) zu Lysin (K) an Position 179 (E179K) in der N-terminalen Ankyrin-Repeat-Domäne 4. Bei chronischen Schmerzpatienten, die unter ‚paradoxical heat sensation‘ (PHS) litten, wurde diese E179K-Variante signifikant häufiger beobachtet. Es wurde folglich die Hypothese aufgestellt, dass die Variante zu einer ‚loss of function‘ des TRPA1-Kanals führt. Im Rahmen dieser Arbeit sollte ermittelt werden, ob die TRPA1-E179K-Varianten in einem HEK 293T/17-Zell-in-vitro-Expressionssystem unterschiedliche Expression und/oder Funktion aufweisen. Auf mRNA- und Protein-Ebene zeigten die Ergebnisse, dass der Wildtyp 710G im Vergleich zur Variante 710A nach thermaler Stimulation signifikant stärker exprimiert wurde. Bei den Versuchen zum Nachweis des Trafficking des TRPA1-Proteins wurde gezeigt, dass der Wildtyp E179-TRPA1 in der Zellmembran bei Stimulation mit Kälte transloziert wird. Bei der Variante K179-TRPA1 war dies nicht zu beobachten. In der Immunhistochemie wurden bei Stimulation mit Kälte und Hitze Proteine beider Varianten zum Teil in der Zellmembran transloziert. Bei Experimenten zur Prüfung der Funktionalität zeigte der Kalzium-Influx beim Wildtyp E179 nach 5 min die maximale Ca2+-Konzentration. Bei der K179-Variante war dagegen kein erhöhter Influx zu messen. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die E179K-Variante nicht funktionsfähig ist und dass womöglich diese loss-of-function zu Disinhibition des physiologischen Gleichgewichtes zwischen kälte- und wärmevermittelten Signalkaskaden und damit zu PHS führen kann