Mixed hematopoietic chimerism and immune tolerance through bone marrow transplantation and infusion of regulatory T cells in a preclinical large animal model

Induction of transplantation tolerance to kidney allografts has been achieved through transient mixed hematopoietic chimerism in a non-myeloablative approach in both, non-human primates and humans. In order to make this approach applicable to other organs less tolerogenic such as lung or heart, we studied an approach to induce long-term mixed chimerism (instead of transient) through bone marrow transplantation (BMT) and infusion of recipient in vitro-expanded regulatory T cells (Tregs) in a non-human primate model (Cynomolgus macaque). Immunosuppression monotherapy was discontinued shortly after BMT. Donor-recipient pairs were major-histocompatibility-complex (MHC) mismatched in order to increase the applicability of this approach. First, we studied the biology of Mauritian Cynomolgus macaque (MCM) Tregs and developed five in vitro Treg expansion protocols for translational studies that included the use of artificial antigen presenting cells (aAPCs), donor peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) or a pool from different donors of CD40L-stimulated B cells (CD40L-sBc). Tregs from all protocols suppressed the proliferation of anti-CD2CD3CD28 bead-stimulated autologous PBMCs albeit with different potencies, varying from 1:2-1:4 Treg:PBMC ratios, up to >1:32. Treg expansion varied between protocols but at least 1,000 fold expansion was achieved with all of the them, up to >7,000 folds. Reculture of cryopreserved Tregs permitted reexpansion with improved suppressive activity. Occasionally, CD8 contamination was observed and resolved by resorting. Specificity studies showed suppression of PBMCs from autologous cells, cells from the same donor used for stimulation during the Treg cultures and from a third‐party PBMC responders, suggestive of the polyclonallity of these Tregs. Similar to humans, the Treg–specific demethylated region (TSDR) within the FoxP3 locus correlated with suppressive activity and expression of FoxP3. Contrary to humans, FoxP3 expression did not correlate with CD45RA or CD127 expression.We then investigated the efficacy of ex vivo expanded Tregs to promote the induction of durable mixed chimerism along with BMT. A total of ten recipients received Tregs with different doses of bone marrow (BM) and outcomes were compared to five controls that did not receive Tregs. Prolonged chimerism was observed in Treg-treated recipients that received a high BM dose with infusion of Tregs compared to those that received low-dose BMT or did not received Tregs. Graft-versus-host disease (GVHD) was observed in four recipients, two controls and two animals that received Tregs expanded with CD40L-sBc. In those animals in which prolonged chimerism was observed, a higher number of peripheral Tregs was detected in blood compared to baseline levels and in vitro, the anti-donor response was decreased, suggestive of donor tolerance. BM rejection and chimerism loss was associated with an inversion of the CD4 and CD8 ratios and an increase in the CD8 absolute counts. Cytomegalovirus (CMV) was detected in all recipients post-BMT independently of the administration of Tregs. CMV reactivation was associated with an increase in the CD8 counts and with the loss of the BM graft. Therefore, promptly antiviral treatment was stablished for an early CMV control. In conclusion, Tregs were able to expand the duration of chimerism (albeit transient) when administered with high-dose BMT across MHC barriers without immunosuppression. <br /

La reacción de hipersensibilidad tipo I en la especie canina: dermatitis atópica canina y otras enfermedades alérgicas

La reacción de hipersensibilidad tipo I (hipersensibilidad inmediata) es una reacción inmediata que se produce cuando un antígeno se combina con un anticuerpo (IgE) preformado (creado por una exposición sensibilizante al mismo antígeno) y se une a los mastocitos provocando una reacción instantánea: sustancias inflamatorias y vasoactivas son liberadas por esas células, causando vasodilatación, edema, quimiotaxis eosinofílica, prurito y broncoconstricción. Los ejemplos más importantes de reacciones de hipersensibilidad inmediatas en medicina veterinaria van desde trastornos alérgicos sistémicos (anafilaxis) hasta trastornos alérgicos específicos tales como alergias respiratorias y oculares (rinitis alérgica, bronquitis y conjuntivitis), alergias alimentarias y alergias cutáneas. Los trastornos alérgicos de la piel son los más relevantes en la especie canina, especialmente un síndrome multifactorial denominado Dermatitis Atópica Canina, sufrido por entre el 10 y el 15% de la población canina. En la primera década del siglo XX, el científico austriaco Clemens von Pirquet introdujo el término "alergia" en el mundo de la medicina humana. Posteriormente el concepto se extendió al campo veterinario y ya en 1941 se informó de un caso de manifestaciones clínicas compatibles con atopia canina en un perro afectado de rinitis alérgica estacional. Justo en 1971 se describieron inicialmente los signos clínicos de CAD. Las condiciones alérgicas suelen ser multifactoriales y en ellas intervienen tanto factores intrínsecos, únicos del animal, como factores extrínsecos, relacionados con el medio ambiente y con el microambiente cutáneo. Una comprensión completa de estos factores es necesaria si la condición se quiere abordar con éxito desde el punto de vista diagnóstico y terapéutico

Caracterización de células mesenquimales de ovino infectado con scrapie

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) son enfermedades neuro-degenerativas sin tratamiento posible. En las últimas décadas se han desarrollado modelos celulares tanto para el estudio de los mecanismos moleculares de la enfermedad como para su posible aplicación en el diagnóstico precoz y para la evaluación de tratamientos in vitro. Sin embargo, existen muy pocos modelos celulares capaces de multiplicar la proteína prión patológica, la mayoría son derivados murinos que requieren la adaptación previa del aislado priónico en ratón antes de su multiplicación. Uno de los objetivos principales del presente estudio consistió en desarrollar un modelo celular que permitiera estudiar el scrapie en células procedentes del hospedador natural de la enfermedad, la especie ovina. Para ello se han estudiado y caracterizado las células mesenquimales (MSC) ovinas obtenidas a partir de sangre periférica y médula ósea. Se ha seleccionado la sangre periférica como tejido de fácil acceso, y la médula ósea por considerarse el lugar de mayor concentración de MSC en animales adultos. En las EET la proteína prión patológica se acumula principalmente en el sistema nervioso central (SNC) y es allí donde ejerce su acción patológica, por ello se ha analizado la plasticidad de las MSC ovinas para su diferenciación neurogénica. Por otra parte, se ha estudiado la susceptibilidad de estas células frente a la infección con el agente de la enfermedad de scrapie. Además, las MSC se han propuesto como posible terapia para las EET por lo que el segundo gran objetivo de esta tesis consistió en analizar los efectos que la enfermedad pueda desencadenar sobre las características de las MSC y su posible infectividad. En este trabajo se describe por primera vez la posibilidad de aislar MSC a partir de sangre periférica de ovino. Tanto las MSC ovinas de este origen como las obtenidas a partir de médula ósea expresan proteínas y transcritos de marcadores de superficie característicos de células mesenquimales. Tal y como se ha descrito en otras especies, se ha observado gran variabilidad individual de las MSC ovinas, que parece afectar tanto a la capacidad de diferenciación como a la plasticidad de estas células. Las MSC ovinas expresan la proteína prión celular y son susceptibles a la infección con aislados priónicos procedentes de animales afectados por scrapie, si bien, a diferencia de lo que ocurre en las MSC de ratón, no parecen propagar la proteína prión patológica. Sin embargo, la infección de BM-MSC con proteína priónica reduce la capacidad de proliferación de las MSC. Este hecho podría deberse a un efecto tóxico del prión y a la inducción de procesos apoptóticos. Estas características ratifican el potencial de las MSC ovinas como modelo celular en el hospedador natural de la enfermedad de scrapie para estudios de toxicidad de la proteína prión

Autofagia y biomarcadores en las enfermedades priónicas

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EETs), o enfermedades priónicas, son un grupo de trastornos neurodegenerativos fatales que afectan a los animales y al hombre, caracterizados por la acumulación de una isoforma infecciosa (PrPSc) de la proteína prion celular (PrPc) en el sistema nervioso central (SNC). Utilizando el scrapie ovino como modelo animal de EET, en la presente Tesis Doctoral hemos analizado la posible implicación de la autofagia, un proceso intracelular fundamental que evita la acumulación de orgánulos dañados y proteínas mal plegadas, en la neuropatología asociada a estas enfermedades. Mediante estudios de expresión génica y determinación inmunohistoquímica de algunos de los marcadores de autofagia más utilizados en la actualidad, evaluamos la regulación de este proceso en ovino infectado de forma natural con scrapie clásico, en ovejas inoculadas experimentalmente con scrapie atípico y en el modelo murino transgénico Tg338, el cual sobreexpresa el alelo del gen ovino de la proteína prion (PRNP) más susceptible al scrapie clásico (VRQ).En estos modelos hemos identificado una disminución en los niveles de expresión de genes relacionados con la autofagia como ATG5 y un incremento del marcador p62, una proteína que se acumula en respuesta al deterioro degradativo autofágico, principalmente en las áreas del SNC más afectadas por la enfermedad. El análisis de las dos formas clínicas de scrapie, las cuales difieren en la distribución neuroanatómica tanto de las lesiones histopatólogicas como de los depósitos de PrPSc, nos ha permitido concluir, no sólo que la maquinaria autofágica se encuentra alterada durante el curso de la infección priónica, sino también que dicha alteración está relacionada con la neuropatología de la enfermedad y es en gran medida dependiente de las características lesionales particulares de la región del SNC analizada. Por otro lado, en la línea transgénica murina Tg338 hemos demostrado que la disfunción de la autofagia tiene lugar durante las fases tardías de la infección priónica. Aunque este modelo experimental muestra una regulación autofágica diferencial con respecto a ratones de tipo wild-type, probablemente debido a la sobreexpresión de la PrPc, en general, la línea murina Tg338 presenta una respuesta a la infección con scrapie clásico y una actividad autofágica similares a las observadas en el ovino, por lo que puede considerarse un método in vivo adecuado para estudiar la autofagia y las EETs de manera conjunta.En la actualidad, el único diagnóstico efectivo de las enfermedades priónicas se basa en la detección directa de la PrPSc en el SNC de manera post-mortem o en tejidos y fluidos periféricos mediante técnicas de amplificación in vitro. La detección de la PrPSc no se considera fiable para el diagnóstico in vivo, y algunas de las técnicas de amplificación son costosas y requieren de laboratorios especializados. En esta Tesis Doctoral hemos realizado diversos estudios dirigidos a la identificación de biomarcadores distintos a la PrPSc y a la validación de potenciales biomarcadores génicos ya identificados para proporcionar alternativas útiles a la metodología diagnóstica actual.Mediante RT-qPCR estudiamos la expresión de diez genes, cuya implicación en la propagación priónica había sido descrita previamente in vitro, en la médula oblongada de ovino con scrapie natural. De todos ellos, detectamos una regulación diferencial en BAMBI y CHGA, por lo que estos dos marcadores se analizaron posteriormente mediante inmunohistoquímica en el modelo ovino y en el modelo murino Tg338. Los cambios de expresión de estos genes tanto a nivel génico como proteico en ambos modelos de scrapie sugieren que podrían desempeñar un papel relevante en la neuropatología de las EETs in vivo, señalándolos a su vez como potenciales biomarcadores de la enfermedad. Además, las proteínas codificadas por BAMBI y CHGA muestran una relación, no sólo con la replicación del prion, sino también con la microgliosis reactiva asociada a estas enfermedades.Por otro lado, los microRNAs (miRNAs) circulantes han sido propuestos como potenciales biomarcadores en una amplia variedad de patologías, incluidas las enfermedades neurodegenerativas. En esta Tesis Doctoral hemos analizado, en plasma sanguíneo y líquido cefalorraquídeo (LCR) de ovino con scrapie, una batería de miRNAs que han mostrado cambios de expresión en otros modelos de EET, demostrando por primera vez alteraciones en los niveles de varios miRNAs circulantes en una enfermedad priónica de origen natural. En los animales infectados con scrapie detectamos un incremento de miR-342-3p y miR-21-5p en plasma, y de miR-342-3p, miR-146a-5p, miR-128-3p y miR-21-5p en LCR, por lo que estas moléculas pueden ser candidatas adecuadas para ser utilizadas como nuevos biomarcadores de la enfermedad. A pesar de que también analizamos sus perfiles de expresión en la fracción exosomal de ambos fluidos biológicos con el fin de concentrar la señal de estos miRNAs y así poder proporcionar un método de diagnóstico más sensible, la purificación de exosomas no mejoró la señal de amplificación de estas moléculas, o al menos, de la batería de miRNAs seleccionada.Finalmente, evaluamos la presencia de la PrPSc en exosomas circulantes mediante PMCA, ya que la circulación del prion a través del organismo podría estar facilitada por estas vesículas y, por tanto, podrían ser en parte responsables de la prionemia descrita en scrapie. En los exosomas aislados de plasma de ovino con scrapie no detectamos la presencia de la proteína patológica, por lo que la fracción exosomal de la sangre no parece estar implicada en la ruta hematógena de neuroinvasión en este hospedador, ni su análisis resulta adecuado para diagnosticar la enfermedad in vivo. Por el contrario, la detección de la PrPSc en los exosomas aislados de LCR podría representar un biomarcador útil para facilitar el diagnóstico in vivo de las EETs durante las últimas etapas de la enfermedad, ya que la amplificación de esta proteína fue positiva en la gran mayoría de muestras procedentes de animales en fase clínica.Mediante un compendio de seis estudios, en esta Tesis Doctoral se ha analizado la implicación de la autofagia en las EETs y se ha profundizado en la validación de potenciales biomarcadores de estas enfermedades mediante el estudio de genes codificantes de proteínas, miRNAs y exosomas circulantes, cumpliendo los objetivos planteados al inicio de la misma.<br /

Caracterización de microorganismos asociados a procesos patológicos en especies de interés veterinario.

Este trabajo fin de grado ha consistido en la realización de un seguimiento diagnóstico post-mortem de un gato con dermatitis necrótica. Se le realizó un estudio histopatológico de la lesión, cultivo del agente y posterior diagnóstico molecular mediante secuenciación génica. La secuencia de nucleótidos obtenida se comparó en la base de datos GenBank donde se mostró un 100% de identidad con Aspergillus tubingensis

Estudio de los mecanismos implicados en la barrera de transmisión y en la patogenia de las enfermedades priónicas

Las enfermedades priónicas han sido descritas en numerosas especies de mamíferos, pudiendo tener un origen espontáneo, familiar o adquirido. Sin embargo, ciertas especies, entre ellas los miembros de la familia Canidae, han demostrado presentar una escasa susceptibilidad a estos procesos. Algunas variantes aminoacídicas de la PrPC son factores determinantes en la susceptibilidad a las enfermedades priónicas. Estudios anteriores utilizando modelos murinos transgénicos revelaron la importancia del cambio aminoacídico N>D, característico de los cánidos, en la resistencia a diversas cepas priónicas. El estudio número 1 se diseñó con el objetivo de comprobar si la PrP con esta sustitución (PrP N158D) puede actuar como una proteína dominante negativa y prevenir la formación de PrPSc cuando se coexpresa con la proteína murina de tipo salvaje o wild-type. Los ratones transgénicos que coexpresaban la PrP mutada mostraron un incremento significativo del periodo de supervivencia (entre un 45 y un 113% de retraso en la aparición de la enfermedad), con respecto a ratones control que expresaban un nivel similar de PrPC wild-type, tras la inoculación de distintas cepas priónicas murinas (22L, ME7, RML y 301C). Asimismo, los ratones que expresaban la PrP mutada no mostraron alteraciones en las características neuropatológicas y bioquímicas desarrolladas, indicando que la prolongación del periodo de supervivencia no se debió a cambios en las cepas inoculadas causadas por el cambio aminoacídico introducido. Estos resultados demuestran que esta sustitución específica de los cánidos proporciona a la PrP la capacidad de actuar como proteína dominante negativa, atenuando la conversión de la PrPC en la forma patógena y retrasando la aparición de la enfermedad tras la inoculación de cepas priónicas de distintas características. El estudio número 2 surge como una continuación del primero. En este estudio se analiza el efecto de esta misma sustitución cuando se introduce en la PrPC de una especie muy susceptible a numerosas enfermedades priónicas. Como modelos de alta susceptibilidad a las EET se seleccionaron ratones transgénicos que sobreexpresaban la PrPC I109 del bank vole, la cual es tan susceptible al malplegamiento que su sola sobreexpresión ocasiona que estos ratones desarrollen una EET de forma espontánea, Así pues, en el segundo estudio se inocularon ratones TgVole-N159D, que sobreexpresan la PrPC I109 del bank vole y son portadores de la sustitución aminoacídica de interés, con dos cepas priónicas distintas la CWD-vole y una cepa atípica de origen espontáneo. Como resultado de ello se observó que estos animales presentaron periodos de supervivencia de un 52 a un 108% más largos que los obtenidos en ratones TgVole sin la sustitución. Además, este residuo aminoacídico fue capaz de prolongar el periodo de supervivencia, no sólo en los ratones inoculados, sino en en los que habían desarrollado la EET espontánea. Al igual que se observó en el estudio 1, no se detectaron diferencias entre las características neuropatológicas desarrolladas por ambos modelos transgénicos. Estos resultados demuestran que el cambio aminoacídico N>D característico de los cánidos produce un efecto protector frente a la propagación de priones de muy distinto origen, incluso cuando se expresa en una PrPC muy susceptible al malplegamiento. Estos dos primeros estudios indican que la sustitución aminoacídica N>D, típica de especies poco susceptibles a las EET, podría ser una candidata interesante en el desarrollo de futuras terapias génicas frente a estas enfermedades. Tras la crisis de la EEB y la aparición de la vECJ en la especie humana, el conocimiento de los mecanismos relacionados con la transmisibilidad de las EET entre especies se convirtió en un motivo de preocupación pública. La implicación de la glicosilación de la PrPC en la conversión en forma patógena de la proteína y en la transmisión interespecie de los priones se ha estudiado ampliamente, si bien se han obtenido resultados controvertidos. En el estudio número 3 se evalúa el efecto de la glicosilación de la PrPC humana en la barrera de transmisión y en las propiedades de distintas cepas priónicas. Se utilizaron aislados de scrapie clásico, scrapie atípico, ECC, BSE-L y BSE-H (EEB atípicas), BSE-C (EEB clásica), EEB ovina, EEB porcina y vECJ en experimentos in vitro e in vivo con el fin de analizar la capacidad de propagación de estos aislados en un modelo que expresa una PrPC humana sin glicosilar (línea transgénica TgNN6h). Sólo las cepas relacionadas con la BSE (BSE-C, EEB ovina, EEB porcina y vECJ) se propagaron en el sustrato humano no glicosilado, lo cual sugiere que la barrera de transmisión humana para las EET se mantuvo. En el bioensayo, a excepción de la vECJ, la inoculación directa de estos mismos aislados no provocó enfermedad en los ratones TgNN6h en un primer pase. Sin embargo, tras la adaptación al sustrato TgNN6h de tres aislados de EEB (bovina, ovina y porcina) por PMCA y la inoculación de estos en ratones se consiguió una transmisión muy eficiente. Los animales TgNN6h inoculados con los inóculos adaptados por PMCA o el aislado directo de vECJ desarrollaron las características neuropatológicas y bioquímicas clásicas de la EEB, lo cual sugiere que la ausencia de glicanos en la PrPC humana no altera las características patobiológicas de la EEB. Los mecanismos reguladores de la patogenia de las EET, especialmente los de las formas esporádicas de estos procesos, siguen siendo en su mayor parte desconocidos. Existen numerosos estudios que indican que la acumulación de proteínas malplegadas, no sólo en las enfermedades priónicas, sino en otras enfermedades neurodegenerativas, podrían inducir estrés del retículo endoplásmico y/o un bloqueo de la degradación proteica por parte del sistema ubiquitino-proteasómico. Por ello, en el estudio número 4 analizamos por medio de técnicas inmunohistoquímicas dos marcadores relacionados con estos procesos, en muestras de encéfalo de modelos murinos de EET espontánea (TgVole). Asimismo, estos ratones expresaban el marcador UbG76V-GFP (línea TgU1), cuya acumulación indica una disfunción de la degradación proteasómica. Por tanto, la acumulación de UbG76V-GFP se seleccionó como marcador del bloqueo de la degradación del sistema ubiquitino-proteasómico y la proteína PDI como marcador de estrés del retículo endoplásmico. Se seleccionaron ratones TgU1+/TgVole+ de distintas edades para evaluar estos procesos en las fases preclínica y clínica de la enfermedad espontánea. Como controles se seleccionaron ratones TgU1+/TgVole- de similares edades. Los animales TgU1+/TgVole+ clínicos mostraron una acumulación de PDI y UbG76V-GFP significativamente mayor que los controles de la misma edad en determinadas áreas del encéfalo. Sin embargo, en los ratones preclínicos TgU1+/TgVole+ no se detectó incremento significativo del estrés del retículo endoplásmico ni pérdida significativa de la función del proteasoma en ninguna de las regiones del encéfalo analizadas. Por ello, ninguno de estos procesos parece ocurrir tempranamente en la patogenia de las formas espontáneas de las EET. Se observó, asimismo, que los ratones TgU1+/TgVole+, especialmente los clínicos, mostraron una intensa acumulación de UbG76V-GFP en astrocitos reactivos. Estos resultados preliminares parecen indicar que tanto el estrés del retículo endoplásmico como la disminución de la degradación proteica por parte del proteasoma son mecanismos secundarios que aparecen asociados con el desarrollo de los cambios neuropatológicos en el encéfalo en las EET espontáneas, en lugar de mecanismos clave en la patogenia de estas enfermedades. Finalmente, en el estudio número 5 analizamos el patrón de distribución inmunohistoquímico de la PrPCWD en el SNC y en un amplio rango de tejidos periféricos procedentes de diez ciervos de cola blanca (Odocoileus virginianus) de distinto genotipo para el gen PRNP: 5 animales Q95G96/Q95G96 (wt/wt), 3 animales S96/wt, 1 animal H95/wt y 1 animal H95/S96. Estos ciervos se encontraban en la fase terminal de la ECC tras la inoculación oral de la cepa Wisc-1. Todos los animales mostraron un patrón de depósito de PrPCWD similar en el SNC, aunque se observaron diferencias entre los distintos genotipos en el cerebelo, lo cual podría estar asociado a interacciones entre el agente infeccioso y factores propios del hospedador, entre otros su genotipo para el gen PRNP. Asimismo, el animal H95/S96 acumuló menores niveles de PrPCWD en comparación con el resto de los genotipos en áreas rostrales del encéfalo, lo cual puede ser explicado por la existencia de un fenómeno de barrera de transmisión intraespecie o por ciertas diferencias en las propiedades de los priones acumulados por este animal. No obstante, el hallazgo más significativo de este estudio es que se observó que los ciervos que expresaban el alelo de resistencia H95 (los animales de los genotipos H95/wt y H95/S96) acumularon una cantidad no detectable, o significativamente menor de PrPCWD , en varios tejidos periféricos, en comparación con los demás genotipos. Las mayores diferencias se observaron en páncreas, corazón, riñón e intestino. Además, se describe por primera vez el depósito de PrPCWD, detectado mediante técnicas convencionales, en las arterias renales de cérvidos infectados por ECC. Por último, ninguno de los animales mostró acumulación de PrPCWD en el músculo esquelético. Estos cinco estudios han cumplido los objetivos descritos al inicio de la tesis, y contribuyen a conocer mejor los mecanismos reguladores de la barrera de transmisión para las EET, así como ciertos aspectos relacionados con su patogenia<br /

Fenómeno de cepas y determinantes moleculares de la barrera de transmisión y la neurodegeneración en las enfermedades priónicas

La existencia de cepas en las enfermedades priónicas ha sido objeto de controversia debido a la naturaleza del agente causal de estas patologías, que, según la hipótesis más ampliamente aceptada, carece de cualquier ácido nucleico cuyos polimorfismos pudieran explicar la variabilidad de los fenotipos observados. Las evidencias experimentales reunidas hasta la fecha, no obstante, indican que las cepas existen y que sus propiedades están codificadas en la conformación de las moléculas de PrPSc. Los modelos más actuales consideran que los aislados priónicos constituyen una “nube” de diversos componentes, “subcepas” o “cuasi-especies”, que coexisten en un equilibro inestable y de los cuales uno predomina y determina el fenotipo. Asimismo, estos modelos interpretan las cepas y las barreras de transmisión como dos manifestaciones del mismo fenómeno fundamental: la naturaleza conformacional de los procesos de selección y propagación de los priones.El fenómeno de cepas de priones y la capacidad natural de los estos agentes para adaptarse a nuevos hospedadores dificultan la monitorización y el control de la enfermedad de scrapie, lo que conlleva el riesgo de una aparición inadvertida de nuevas variantes con potencial zoonótico. Resulta por lo tanto crucial caracterizar la variabilidad de cepas presentes en los rebaños ovinos europeos, así como profundizar en la compresión de los fenómenos de selección y adaptación de los priones.Por ello, en el estudio nº 1 se realiza un análisis exhaustivo de varios aislados de scrapie natural de la zona fronteriza transpirenaica mediante bioensayo en las líneas transgénicas ovinas TgShp XI y Tg338. A pesar de que el análisis bioquímico de los aislados originales ovinos mostró resultados bastante homogéneos (con la excepción del inóculo 8L, todos contenían PrPres de 19 kDa), algunos de estos aislados produjeron acumulación de PrPres de 21 kDa en el tejido nervioso de los ratones TgShp XI, aunque sus periodos de supervivencia y características neuropatológicas no fueron diferentes de las del resto de inóculos. Otro grupo de aislados provocó periodos de supervivencia muy largos con bajas tasas de ataque y acumulación de PrPres de 21 kDa en ratones Tg338. Estos animales también presentaban una neuropatología menos severa, con una distribución de las lesiones espongiformes más limitada y la presencia ocasional de placas de amiloide en el encéfalo.Estos resultados sugieren que algunos de los aislados estudiados contienen mezclas de varios componentes, que pueden ser diferenciados y selectivamente amplificados empleando distintos modelos transgénicos. Se identificaron al menos tres subcepas diferentes: una isoforma mayoritaria de 19 kDa, presente en todos los aislados, y dos componentes de 21 kDa, uno que sólo se replica en ratones TgShp XI y otro que aparentemente es capaz de interferir con la propagación de la subcepa dominante en ratones Tg338, restringiendo las lesiones neuropatológicas y prolongando los periodos de supervivencia; es posible que esta interferencia esté mediada por su capacidad amiloidogénica.En contra de la posibilidad de que las subcepas de 21 kDa surgieran de novo por mutación del componente mayoritario de 19 kDa, el hecho de que sólo una proporción de los inóculos provocara este fenotipo hace suponer que dichas subcepas estaban presentes en los inóculos originales en una baja concentración. Sin embargo, la razón por la que cada línea transgénica fue capaz de propagar sólo uno de estos componentes minoritarios se desconoce. Factores como la secuencia de la PrPC ovina que expresan, e incluso los niveles de expresión de PrPC, son capaces de alterar la susceptibilidad selectiva a distintas cepas. En cualquier caso, los resultados de este trabajo sugieren que la coinfección de los animales con más de una cepa de scrapie es más frecuente que la infección con una sola cepa, y que distintos tejidos y órganos pueden acumular cepas diferentes.Las barreras de transmisión están fundamentalmente moduladas por el grado de correspondencia entre las secuencias primarias de la PrPSc entrante y la PrPC del hospedador. Sin embargo, existen otros factores que influyen, como el grado de glicosilación de la PrPC, que se sabe que es capaz de modificar la susceptibilidad de los ratones a la infección con diversas cepas priónicas, así como la eficiencia de propagación in vitro. El empleo de sustratos de PrPC no glicosilada en PMCA ha permitido la amplificación de algunas cepas de priones difíciles de transmitir a modelos murinos. En el estudio nº 2 se explora el efecto que tiene la eliminación de los glicanos sobre la capacidad de propagación in vitro y de transmisión in vivo de los priones responsables de varios tipos de enfermedades priónicas humanas con características atípicas. Para ello se empleó la línea transgénica TgNN6h, que expresa una PrPC humana con mutaciones en los residuos de asparagina 181 y 197, lo que impide su glicosilación. Este tipo de sustrato permitió la amplificación por PMCA de varias cepas priónicas clásicas y atípicas, entre ellas la cepa GSS A117V. La inoculación de esta cepa, previamente adaptada in vitro, en ratones TgNN6h causó el desarrollo de una enfermedad con características neuropatológicas que se correspondían con las de los pacientes humanos, lo que demuestra el mantenimiento de las propiedades de cepa. Por otra parte, el aislado de GSS 6OPRI parecía contener una mezcla de subcepas clásica y atípica, que se manifestaban respectivamente al realizar el bioensayo en un modelo normalmente glicosilada (Tg340) o en el modelo TgNN6h. Finalmente, la inoculación de cualquiera de las cepas atípicas, previamente adaptadas al sustrato no glicosilado por PMCA, no causaba enfermedad en ratones Tg340. En conjunto, estos resultados sugieren que la eliminación de los glicanos facilita la amplificación selectiva de priones con características atípicas, mientras que la presencia de los mismos impide su propagación.En la patogenia de enfermedades priónicas juega un papel clave la muerte neuronal. Sin embargo, los mecanismos que subyacen a este proceso se desconocen. Varios estudios han sugerido la implicación de un grupo de factores de crecimiento específicos del sistema nervioso denominados neurotrofinas. De entre los receptores a través de los cuales actúan, p75NTR es el más interesante, ya que se ha visto que es capaz de mediar respuestas tanto de supervivencia como de muerte celular en función de varios factores. En el estudio nº 3 se analiza la distribución de esta proteína y su correlación con otros marcadores neuropatológicos de enfermedad priónica en el encéfalo de animales natural y experimentalmente infectados. En ratones Tg338, p75NTR mostró un marcaje glial astrocítico, que era más abundante en individuos infectados en estadio terminal y que se correlacionaba con la espongiosis, el depósito de PrPSc y la gliosis, sugiriendo una implicación de los astrocitos en la patogenia de la neurodegeneración. Por otra parte, los ovinos infectados en estadio preclínico mostraban mayores niveles de inmunomarcaje que los individuos terminales y que los controles, lo que sugiere una sobreexpresión de p75NTR en los estadios tempranos del proceso neurodegenerativo en ovinos, que posteriormente se vería contrarrestada por la pérdida neuronal. Las técnicas diagnósticas de enfermedad priónica actuales poseen una efectividad limitada. El único biomarcador patognomónico de la enfermedad es la presencia de PrPSc en el sistema nervioso, lo que sólo puede demostrarse post-mortem. En consecuencia, se hace precisa la identificación de nuevos biomarcadores, que sean mensurables en tejidos y fluidos fácilmente obtenibles, como la sangre o el líquido cefalorraquídeo (LCR), y que permitan el diagnóstico de los individuos en el estadio preclínico de la enfermedad. Sin embargo, las muestras de pacientes humanos con estas características son escasas y difíciles de conseguir, por lo que es necesario el empleo de modelos alternativos válidos dónde buscar nuevos biomarcadores y testar los ya existentes. En el scrapie clásico, la identificación de animales preclínicos puede realizarse fácilmente mediante la detección inmunohistoquímica de PrPSc en muestras obtenidas por biopsia rectal, aunque la sensibilidad de esta técnica no es la deseable, ya que existen genotipos de Prnp ovino en los que la PrPSc no se disemina por tejido linfoide asociado a mucosa rectal. En el estudio nº 4, se emplearon muestras de LCR de ovinos infectados en estadios terminal y preclínico para validar varios biomarcadores empleados en el diagnóstico rutinario de EET humanas. Los marcadores subrogados de daño neuronal proteína 14-3-3 y tau total se encontraron aumentados exclusivamente en LCR de individuos terminales. Sin embargo, los niveles de PrP total en LCR se encontraron disminuidos también en estadio preclínico. Por su parte, la medida de la “seeding activity” por RT-QuIC en LCR demostró una sensibilidad del 78% en casos terminales y del 62% en preclínicos, mientras que la especificidad fue del 100%. Estos resultados son coherentes con lo visto en pacientes humanos y demuestran la eficacia de estas técnicas para detectar animales positivos de la especie ovina.<br /

Presencia de Clostridioides difficile en conejos y buitres.

En los últimos años se ha evidenciado un cambio en la epidemiología de la enfermedad producida por Clostridium difficile en humanos, principalmente asociado a la aparición de nuevos ribotipos hipervirulentos y al aumento de la incidencia de infecciones adquiridas en comunidad. Uno de los posibles factores sospechosos de favorecer este cambio es que los animales tengan un papel en la trasmisión de este patógeno, convirtiendo a C. difficile en un agente zoonótico. Este trabajo se centra en el análisis de muestras de dos orígenes distintos: buitres alimentados con cadáveres de cerdo y granjas de conejos. El objetivo es caracterizar los aislados obtenidos para ampliar la información existente en España, donde existen pocos estudios sobre el tema. La metodología utilizada se basa en el aislamiento de C. difficile en dichas muestras, estudiando posteriormente su prevalencia, ribotipo, presencia de toxinas y susceptibilidad antibiótica. Aunque la información obtenida es limitada debido al bajo tamaño de muestra, los resultados son similares a los obtenidos en otros estudios, por lo que se apunta la posibilidad de que C. difficile tenga implicación en trasmisiones interespecie y carácter zoonótico, destacando en este último caso el papel del ribotipo hipervirulento 078. Los resultados obtenidos sobre el nivel de resistencia de los aislados señalan una elevada resistencia a fluoroquinolonas, destacando el caso de los procedentes de buitres, ya que no son animales que reciban tratamientos antibióticos a lo largo de su vida a diferencia de los animales de ganadería. Estos resultados ponen de manifiesto la necesidad de continuar trabajando en planes de control de este patógeno y reducción de resistencias a antibióticos.<br /

Contribuciones al estudio de biomarcadores, terapia y fenómeno de cepas en las enfermedades priónicas

Las enfermedades priónicas son trastornos neurodegenerativos mortales que no se pueden prevenir o tratar, por lo que actualmente muchas de las investigaciones en torno a estas enfermedades se centran en el desarrollo de tratamientos específicos. Se considera que parte de la muerte neuronal que ocurre en las enfermedades priónicas se debe a la activación de la apoptosis y la alteración de la homeostasis de mecanismos autofágicos. El fragmento C-terminal no tóxico de la toxina tetánica (TTC) se ha descrito como una molécula neuroprotectora que se une a los receptores Trk desencadenando vías de supervivencia neuronal, inhibiendo la apoptosis y regulando la autofagia. Debido a esto, en el estudio número 1 de esta tesis, se presenta un estudio piloto para probar el potencial terapéutico del TTC en las enfermedades priónicas. Ratones wild type de la línea C57BL6 y ratones transgénicos Tg338, que sobreexpresan la PrPC ovina en su variante VRQ/VRQ, se inocularon intracerebralmente con el agente priónico del scrapie y luego fueron tratados mediante la inyección intramuscular de TTC. Los resultados de este estudio muestran, en el grupo tratado de ambos modelos murinos, una disminución de las proteínas caspasa-3 y p62 y un aumento de LC3B y NeuN a nivel encefálico. Además, los ratones wild type tratados mostraron diferencias en la regulación de la expresión génica de Atg5, Becn1 y Fbxw7. Así, se observa que la inyección de TTC generó efectos neuroprotectores en ambos modelos murinos de enfermedad priónica a través de la reducción de la apoptosis y de la regulación de la autofagia, lo que resultó en un aumento de la supervivencia neuronal, pese a no aumentar el tiempo de supervivencia. Estos hallazgos refuerzan el papel del TTC como regulador de la apoptosis y la autofagia en enfermedades neurodegenerativas y, lo que es más importante, como molécula neuroprotectora. Otro de los principales focos de las investigaciones actuales en enfermedades priónicas está en la búsqueda de biomarcadores que permitan detectar la enfermedad en fases preclínicas. La neurogranina (Ng) y la cadena ligera del neurofilamento (NfL) son proteínas que reflejan el daño sináptico y axonal y se postulan como buenos biomarcadores para trastornos neurodegenerativos. En el estudio número 2, se evalúan Ng y NfL como posibles biomarcadores preclínicos en la enfermedad de scrapie. Para esto, se estudia tanto su concentración proteica como su nivel de expresión génica en el sistema nervioso central (SNC) de ovejas afectadas por scrapie en estadios preclínico y clínico, en comparación con controles sanos. Además, se evalúan también sus niveles en líquido cefalorraquídeo (LCR) y su correlación con los principales eventos neuropatológicos en las enfermedades priónicas, el depósito de PrPSc y la espongiosis. Los resultados muestran una disminución en los niveles de expresión proteica y génica de Ng y NfL a medida que avanza la enfermedad, y cambios significativos entre los animales del grupo control y preclínico. Por el contrario, los niveles de LCR de NfL aumentaron a lo largo de la progresión de la enfermedad. Además, se encontró una correlación negativa entre los marcadores neuropatológicos de enfermedad priónica y la concentración de las proteínas estudiadas. Así, en este estudio se corrobora que la concentración en el tejido nervioso de Ng y NfL, marcadores de daño sináptico y axonal, se ve afectada por la acumulación de priones, y que esta condición es detectable incluso en etapas preclínicas enfermedad priónica. Por lo tanto, los resultados obtenidos respaldan la utilidad de ambas proteínas como biomarcadores preclínicos para enfermedades priónicas. Los priones son patógenos exclusivamente proteicos cuya estructura terciaria y cuaternaria puede diferir, dando lugar a la aparición de diferentes cepas, que se manifiestan a través de variabilidad fenotípica. Además, la capacidad de transmisión de los priones a las diferentes especies está íntimamente ligada con sus características de cepa. Ampliar el conocimiento y la caracterización de las cepas priónicas es crucial para evaluar el potencial de los priones para infectar distintas especies, y para el control y la erradicación de las enfermedades priónicas. En el scrapie, se ha visto que varias cepas pueden propagarse a partir de un mismo aislado, por lo que se considera que, en ciertos casos, distintas cepas coexisten en el aislado original. Por esto, en el estudio número 3, se evalúa, mediante la técnica de Protein Misfolding Cyclic Amplification (PMCA), la presencia de cepas de scrapie asociadas a un perfil de 21kDa en aislados de origen ovino y su evolución durante su transmisión seriada en un bioensayo en ratones que expresan la PrPC ovina. Para esto, se utilizó la PMCA en diferentes condiciones para evaluar la cantidad y proporción de subcomponentes contenidos en distintas muestras del bioensayo. Los resultados muestran que la PMCA se puede utilizar en determinadas condiciones en las que el fenotipo de 19kDa, asociado a una cepa de scrapie, no es amplificable. Bajo estas mismas condiciones, la PMCA es capaz de amplificar el subcomponente de 21kDa del scrapie, asociado a varias cepas distintas de esta enfermedad. A partir del método de PMCA establecido en este estudio, además, se detecta el componente de 21kDa en aislados de scrapie ovino que mostraban en un inicio un perfil de glicosilación de 19kDa. Por tanto, los resultados demuestran, por un lado, que la PMCA se puede utilizar para detectar cepas de 21kDa en homogeneizados que muestran una firma de 19kDa, y también que es capaz de detectar la selección diferencial dependiente del tejido que ocurre en los bioensayos. Por otro lado, y de forma más importante, los resultados sugieren que algunos aislados naturales de scrapie ovino utilizados en el estudio contenían mezclas de cepas y que la coinfección con varias cepas podría ocurrir de forma frecuente en la naturaleza. La generación in vitro de priones recombinantes infecciosos fue un gran logro en la investigación de las enfermedades priónicas ya que permite la producción de PrP recombinante de alta pureza para su uso en futuras investigaciones. Sin embargo, estos priones recombinantes pueden existir y propagarse en muchas conformaciones que pueden diferir en su patogenicidad y ser desde absolutamente inocuas hasta letales, lo que limita su uso como buenos modelos de priones. La generación de priones recombinantes que retengan las características de los priones de mamífero es de crucial importancia, ya que el conocimiento obtenido de los estudios con priones recombinantes podría ayudar a comprender los aspectos desconocidos de la patogénesis de las enfermedades priónicas. En el estudio número 4 de esta tesis, se analizan comparativamente las características de distintas cepas priónicas de mamífero y de sus homólogas recombinantes tras su bioensayo en el modelo TgVole, con el fin de determinar cómo varían sus propiedades biológicas tras propagarse in vitro sobre una proteína recombinante y posteriormente in vivo. Tras la inoculación de las cepas de mamífero de scrapie 22L, RML, 263K y ME7, así como de cepas recombinantes homólogas de éstas en el modelo transgénico TgVole, que expresa la PrPC 109I del bank vole, todas fueron capaces de producir enfermedad en los animales. Además, las cepas recombinantes 22L-PMSA-2 y RML-PMSA-1, obtenidas tras la replicación in vitro de las cepas naturales 22L y RML respectivamente, mostraron una gran similitud con sus homólogas naturales en las características neuropatológicas asociadas a la infección por priones (espongiosis y depósito de PrPSc). Aunque este estudio se completará en el futuro con el análisis de las propiedades bioquímicas de estas cepas, los resultados obtenidos implican que estas dos cepas de scrapie mantienen sus propiedades neuropatológicas tras su propagación en proteína recombinante, y que por lo tanto podrían ser buenos modelos para posteriores estudios. Los cuatro estudios desarrollados en esta tesis han cumplido los objetivos de la misma, ampliando el conocimiento actual tanto sobre la patogenia, diagnóstico y tratamiento de las enfermedades priónicas como de los priones como agentes patógenos. <br /

ESTUDIOS DE RESISTENCIAS ANTIBIÓTICAS A ENROFLOXACINA EN MUESTRAS DE CERDO.

Las bacterias se hacen resistentes a los antimicrobianos por la adquisición de mecanismos de resistencia a través de procesos genéticos, bien de origen plasmídico o del cromosoma bacteriano. La antibiorresistencia supone una amenaza creciente para la Salud pública y la Sanidad Animal, acentuada por el uso indebido de estos fármacos.En este trabajo se han estudiado muestras de cerdos que recibieron un tratamiento antibiótico con enrofloxacina. El objetivo de este estudio es la identificación de géneros bacterianos antibiorresistentes presentes en dichos animales, mediante el uso de medios de agar cromogénicos para el aislamiento selectivo de cepas resistentes a la vancomicina y antibióticos betalactámicos. Se han procesado muestras biológicas procedentes de 12 cerdos, obtenidas a lo largo de seis días de tratamiento antibiótico, y se ha determinado que el género bacteriano predominante es Enterococcus faecium resistente a la vancomicina. Además, se aprecia un patrón común en la frecuencia de aislamiento bacteriano, a lo largo de todo el estudio; E. faecium (62%), E. coli (23%), E. faecalis (4%) y K. pneumoniae (1%). El uso de enrofloxacina supone una modificación de las poblaciones bacterianas presentes en la microbiota de los cerdos. En el caso de K. pneumoniae, esta bacteria muestra mayor sensibilidad a la enrofloxacina, y su frecuencia de aislamiento está reducida en el grupo experimental a diferencia del grupo control. Por el contrario, el género E. coli, se ve favorecido por el uso de enrofloxacina, y su frecuencia es superior en el grupo experimental, a diferencia del grupo control, en el que no se aisló en ninguna muestra.<br /