Récepteurs nicotiniques neuronaux d'insectes et insecticides : Caractérisation de facteurs intracellulaires impliqués dans la modulation de l'efficacité des néonicotinoides (Thèse de Doctorat d'Université)

L\u27utilisation des produitq phytosanitaires est indispensable pour augmenter la qualité des productions agricoles. Cependant les directives européennes et nationales préconisent une réduction de 50% de leur utilisation pour préserver l\u27environnement et limiter les effets secondaires sur les organismes non-cibles. Dans cette optique, et pour optimiser l\u27efficacité de ces produits tout en diminuant leur dose d\u27utilisation, il est nécessaire de caractériser les facteurs cellulaires et moléculaires impliqués dans la modulation de l\u27effet insecticide de ces composés sur leurs cibles membranaires. Parmi les insecticides les plus utilisés en agriculture, les néonicotinoïdes occupent une place importante sur le marché. Ils ont pour cible les récepteurs à l’acétylcholine de type nicotinique (nAChRs) du système nerveux central des insectes. Chez la blatte Periplaneta americana, des cellules neurosecrétrices identifiées, les neurones DUM, expriment deux sous-types de nAChRs, (nAChR1 et nAChR2). Alors que nAChR1 est sensible à l’imidaclopride (IMI), néonicotinoïde de première génération, cet insecticide ne présente aucun effet sur nAChR2. Afin d’obtenir une meilleure compréhension du mode d’action de ces insecticides sur des nAChRs insensibles, l’objectif de ce travail de recherche a été de caractériser du point de vue électro-pharmacologique les facteurs cellulaires et moléculaires qui influencent l’efficacité d’un insecticide néonicotinoïde de seconde génération, l’acétamipride (ACT) qui présente des caractéristiques chimiques différentes de l’IMI. Grâce à la technique électrophysiologique du patch-clamp, dans des conditions de potentiel imposé, il a été possible de démontrer que l’effet de l’ACT sur nAChR2 dépend du potentiel de membrane. Une dépolarisation de la membrane augmente légèrement la sensibilité de nAChR2 pour l’ACT alors qu’une hyper polarisation produit un effet inverse significatif. Dans les deux cas, l’implication du calcium intracellulaire a été démontrée. Pour des potentiels plus positifs que le potentiel de membrane (i.e., -50 mV), l’inhibition de l’influx calcique via l’activation des canaux calci ques à haut seuil d’activation (High Voltage-Activated) par le chlorure de cadmium et l’ω-conotoxine GVIA augmente la sensibilité de nAChR2 pour l’ACT. Des effets similaires sont obtenus pour des potentiels de membrane plus hyperpolarisés lorsque la perméabilité calcique est inhibée par le LOE 908, un inhibiteur des canaux TRPγ. Dans ce dernier cas, l’utilisation d’o utils pharmacologiques spécifiques (e.g., forskoline, W7) a permis de révéler que la voie de signalisation intracellulaire AMPcyclique/adenylate cyclase est impliquée dans la modulation de l’efficacité de l’ACT sur nAChR2. Enfin, des mesures de la résistance membran aire, réalisées en parallèle dans des conditions de courant imposé, indiquent que l’état conformationnel des nAChR2 joue également un rôle important dans la modulation de l’efficacité de l’ACT. L’ensemble de ces résultats qui ont permis d’identifier de nouveaux facteurs cellulaires et moléculaires impliqués dans la modulation de l’efficacité d’un néonicotinoide, l’ACT ouvrent des perspectives très intéressantes pour optimiser l’efficacité d’un traitement insecticide

Etude des sous-unités auxiliaires du canal sodium dépendant du potentiel chez l’insecte : approches moléculaires, électrophysiologiques et pharmacologiques (Thèse de Doctorat d'Université)

Voltage-gated sodium (Nav) channel is a crucial molecular component of the cellular excitability. It represents a target of choice for neurotoxic insecticides used in pest control. Pyrazoline-type insecticide interacts with the main Nav channel subunit with a preference for its inactivated state. A recent study showed that auxiliary subunits of Drosophila melanogaster modified this conformation. However, little information is available concerning the role and the regulation of these auxiliary subunits. The objectives of this thesis were to characterize the auxiliary subunits of the American cockroach Periplaneta americana by molecular, electrophysiological and pharmacological approaches, in order to specify their functions. The first part of this work concerns the neuronal TEH1 subunit. Two variants, PaTEH1A and PaTEH1B resulting from an intron retention modifying only the C-terminal extremity, were cloned. Using the heterologous expression system Xenopus oocytes and the two microelectrodes voltage clamp technique, we highlighted that the C-terminal extremity was involved in the modulation of Nav channels electrophysiological and pharmacological properties. The second part concerns the discovery of other auxiliary subunits. We identified several variants resulting from alternative splicing events (2 variants for PaTipE and 4 for PaTEH2). Altogether, our results indicate that auxiliary subunits are diverse and play an important role in the modulation of Na+ current and should be considered to improve pharmacological studies