Identifizierung während der Apoptose transkriptionell hochregulierter Gene mittels einer viralen Genfalle und Charakterisierung eines dieser Gene: Phosphatidylinositol 4-Phosphat 5-Kinase Ibeta

Zusammenfassung Für die Gewebehomöostase eines Organismus hat die Apoptose eine grundsätzliche Bedeutung. Fehlregulation des programmierten Zelltods kann entweder zu degenerativen Erkrankungen oder Neoplasien führen. Das Verständnis der dem Phänomen Apoptose zugrunde liegenden molekularen Mechanismen ist sowohl für die Erklärung der Pathogenese dieser Erkrankungen als auch für zukünftige rationale Therapieansätze von Bedeutung. Besonders bei der Entwicklung neuer pharmakologischer Substanzen, die gegen Krebs oder neurodegenerative Krankheiten eingesetzt werden können, ist die Entdeckung neuer apoptoserelevanter Gene von ausschlaggebender Relevanz. Das Ziel dieser Arbeit war daher, neue Gene zu finden, deren Expression während der Apoptose induziert wird, und eines dieser Gene funktionell zu charakterisieren. Als Studiensystem wurden IL-3-abhängige Zellen (FDC P1) benutzt, da die Existenz eines schnell aktivierbaren Apoptose-Signalwegs in verschiedensten Zellen zu dem Schluss geführt hatte, dass Überlebensfaktoren diesen Signalweg reprimieren. IL-3 abhängige Zelllinien hören nicht auf zu proliferieren, wenn ihnen IL-3 entzogen wird, vielmehr durchlaufen sie Apoptose. IL-3 sichert also das Überleben der Zellen dadurch, dass apoptoseaktivierende Signal-Kaskaden reprimiert werden. Um neue Komponenten solcher regulatorischer Kaskaden ausfindig zu machen, war es nötig eine Methode zu entwickeln, die es ermöglicht, Zellen trotz eines Apoptosestimulus am Leben zu erhalten. Eine entsprechende Strategie zur Identifizierung eben solcher Gene, die schon erfolgreich bei eine Reihe anderer Fragestellungen eingesetzt worden war, beruht auf dem Einsatz von Genfallen. Aus der Kombination von Genfalleninsertion und dem Cre/loxP-Rekombinationssystem konnte letztendlich eine Methode entwickelt werden, die die Apoptoseinduktion durch IL-3 Entzug einer strikt IL-3 abhängigen Zelllinie erlaubte. Dabei wird, nach gezielter Rekombination, das Gen für den Überlebensfaktor IL-3 exprimiert. Dadurch werden die Zellen unabhängig von exogen zugeführtem Cytokin. Anders als konventionelle Genfallen-Strategien sollte der Cre/loxP-Ansatz nicht nur eine Anreicherung von Genen erlauben, die durch spezifische biologische Stimuli induziert werden, sondern auch die Identifizierung von nur transient exprimierten Genen ermöglichen. Mit Hilfe eines solchen Ansatzes konnte aus der FDC P1-Zelllinie das Gen Phosphatidylinositol 4-Phosphat 5-Kinase isoliert werden. Zur Validierung der transkriptionellen Induktion der identifizierten Gene wurden Northern-Blot Experimente durchgeführt, die zeigten, dass die Transkriptmenge nur in einem eng begrenzten Zeitfenster ansteigt und danach wieder auf das Ausgangsniveau absinkt. Somit erfüllt das gewählte Genfallensystem auch die Forderung nach der Detektion von nur vorübergehend transkriptionell aktivierten Genen. Die Ergebnisse aus den Proliferationsexperimenten mit FDC P1-Zellen zeigten, dass PIP5K in den Zellzyklus eingreift. PIP5K überexperimierende Zellen haben neben einer erhöhten Proliferationsrate (ca. 3-fach höhere Zellzahlen) auch eine verringerte Spontanapoptose (ca. 70% weniger apoptotische Zellen). In Weichagarexperimenten konnte auch eine erhöhte Stressresistenz der Zellen beobachtet werden (ca. 8-fach unter normalen Il-3 Bedingungen). Nachdem in FDC P1-Zellen nur eine moderate Expression von exogener PIP5K erzielt werden konnte, wurden stabile PIP5K-überexprimierende HeLa-Zellpopulationen isoliert. In einer systematischen, biochemischen Analyse von Zellzyklusregulatoren wurden darüber hinaus PIP5K regulierte Zellzyklusproteine identifiziert. So führte die PIP5K Überexpression zu einer Induktion von PCNA, hsMAD2 und DNA-Polymerase , und zu einer Repression von p21/Cip1/Waf1. Schließlich wurde die Rolle von PIP5K während der, durch alternative Stimuli induzierten Apoptose in HeLa-Zellen untersucht. Es zeigte sich, dass PIP5K die zytostatika- und strahleninduzierte Apoptose akzeleriert. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass PIP5K den Apoptoseprozess, je nach Stimulus, sowohl verzögern als auch beschleunigen kann. Während PIP5K bei IL-3 Entzug anti-apoptotisch wirkt, geschieht genau das Gegenteil nach zytostatischer Behandlung. Insgesamt spiegelt dies eine subtil aufeinander abgestimmte Regulation von Zellzyklus und Apoptose wieder

Funktionelle Charakterisierung von AtCPK1 und AtCPK2 aus Arabidopsis thaliana unter Verwendung einer chemisch-genetischen Methode

Kalzium-abhängige Proteinkinasen (CDPKs) haben eine biologische Funktion in einer Reihe von zellulären Prozessen, was durch Überexpressionsanalysen und auf Kosuppression-basierten Silencing-Untersuchungen gezeigt werden konnte. Die Untersuchung von CDPK-Mutanten hat jedoch bisher, vermutlich aufgrund der hohen funktionellen Redundanz oder aufgrund von Anpassungsmechanismen der Pflanzen, zu keinen phänotypischen Auffällig¬keiten geführt. Ausschließlich im Falle von NtCDPK2 aus Tabak war es bislang möglich, die biologische Funktion einer einzelnen Isoform aufzuklären. In dieser Arbeit wurde eine chemisch-genetische Methode etabliert, die es ermöglicht, isoformspezifische Untersuchungen von CDPKs durchzuführen. Eine Mutation der ATP-Bindetasche verändert die Nukeotid¬binde¬eigen¬schaften von CDPKs daraufhin, dass sie durch den Kinaseinhibitor 1 NA-PP1 inhibiert werden können. Durch eine biochemische Charakterisierung von NtCDPK2 als Modellenzym konnte gezeigt werden, dass es sich bei dieser Mutation in CDPKs um eine funktionell stille Mutation handelte, die keinen Einfluss auf die Kinase¬aktivität und die Substratspezifität hat. Für eine funktionelle Charakterisierung wurden basierend auf Microarray-Expressions¬daten die beiden zu NtCDPK2 homologen Isoformen AtCPK1 und AtCPK2 aus A. thaliana ausgewählt. Anhand klassischer genetischer Methoden, wie der Analyse von Promotor-GUS Linien, konnte gezeigt werden, dass es sich bei AtCPK1 um eine ubiquitär exprimierte CDPK handelt. AtCPK2 zeigte hingegen eine spezifische Lokalisation in der Wurzelspitze und in Zellen, die sich durch Spitzenwachstum auszeichnen, wie beispielsweise Pollen. Eine Untersuchung des Pollenschlauchwachstums in cpk2-Mutanten zeigte, dass die Pollen¬schläuche signifikant kürzer waren als in Wildtyppflanzen. Für eine reverse chemisch-genetische Analyse von AtCPK1 nach Kältestress wurde eine T-DNA Insertionslinie dieser Isoform mit der ATP-Bindetaschen¬variante von AtCPK1 komple¬mentiert. Eine Analyse von Veränderungen im Phosphoproteom nach Kältestress identi¬fizierte 5 Proteine, die ein differentielles Phosphorylierungsmuster nach chemischer Inhibition zeigten. Eine Metabolomanalyse ergab verschiedene Metabolite, die differentiell reguliert wurden. In dieser Arbeit konnte durch eine klassische Mutantenanalyse von AtCPK2, die Etablierung einer chemisch-genetischen Methode für die Analyse von CDPKs und deren Anwendung für AtCPK1 Hinweise auf biologische Funktionen dieser Isoformen erhalten werden. Dies zeigt, dass die chemisch-genetische Methode klassische genetische Ansätze bei der funktionellen Charakterisierung von CDPKs ergänzen kann und, wie im Falle von AtCPK1, oftmals als einzige Methode eine isoformspezifische Untersuchung gestattet. In einem zweiten Teil wurde in dieser Arbeit die Phosphoregulation von CDPKs näher untersucht. Nach Expression in N. benthamiana konnte eine weitere, stimulusabhängige in vivo Phospho¬rylierungs¬stelle in AtCPK2 bestimmt werden. Zudem wurde für eine Phosphorylierungsstelle in der ATP-Bindetasche von NtCDPK2 eine mögliche Funktion in der Regulation der Kinase¬aktivität postuliert. Diese Phosphorylierungsstelle in der ATP-Bindetasche könnte die Basis eines noch nicht beschriebenen Regulationsmechanismus bilden, der Ähnlichkeiten mit der Regulation von Cyclin-abhängigen Kinasen hat

Charakterisierung der humoralen Immunantwort bei der Multiplen Sklerose

Die MS ist eine chronisch-entzündliche und demyelinisierende Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS), deren Pathomechanismus bislang unbekannt ist. Man findet typischerweise eine Infiltration des ZNS durch Immunzellen, wobei ein heterogenes Bild bezüglich der Qualität der Immunreaktion und der histopathologischen Veränderungen im ZNS von MS-Patienten zu beobachten ist. Obwohl körpereigene Immunzellen wahrscheinlich die Mediatoren der Erkrankung sind, ist bislang nicht geklärt, welche Immunzellen pathogenetisch relevant sind. Da der Liquor cerebrospinalis höchstwahrscheinlich die inflammatorischen Vorgänge im ZNS widerspiegelt, wurde in dieser Arbeit der Liquor auf charakteristische Veränderungen bei der MS analysiert. Dazu wurden Liquor- und Blutzellen von MS-Patienten im Vergleich zu Patienten mit anderen neurologischen Erkrankungen phänotypisiert. Die Analysen zeigten keine wesentlichen Unterschiede im Blut, hingegen war der Liquor von MS-Patienten durch eine Aktivierung der humoralen, B-Zell vermittelten Immunantwort in Form eines erhöhten Anteils an B-Zellen, Plasmazellen und einer Erhöhung der intrathekalen Immunglobulin-G (IgG)-Synthese gekennzeichnet. Je nach Ausprägung der humoralen Immunantwort konnten drei unterschiedliche -im Krankheitsverlauf stabile- Liquorpathologien ausgearbeitet werden: 1. Eine B-Zell dominante Pathologie mit einem hohen Anteil an B-Zellen, wenig Monozyten und einer erhöhten IgG-Synthese, 2. eine Monozyten-dominante Pathologie mit wenig B-Zellen, zahlreichen Monozyten und wenig IgG-Synthese und 3. eine intermediäre Pathologie mit B-Zellen und Monozyten in etwa gleichem Verhältnis und einer moderaten IgG-Synthese. Die Korrelation der unterschiedlichen Liquorpathologien mit klinischen Parametern ergab, dass MS-Patienten mit einer B-Zell dominanten Liquorpathologie eine raschere Krankheitsprogression hatten als Patienten mit umgekehrtem Phänotyp. Die Ergebnisse der Arbeit weisen auf eine Heterogenität in der Liquorpathologie hin und unterstützten die Hypothese, dass die MS eine heterogene Erkrankung mit unterschiedlichen zugrunde liegenden Pathomechanismen ist. Die unterschiedlichen Liquorpathologien geben erstmals die Möglichkeit, die MS-Patienten anhand der Liquortypisierung in Subgruppen zu stratifizieren und möglicherweise eine Aussage über die zu erwartende Krankheitsprogression zu treffen. Der nach wie vor wichtigste Befund für die Diagnose einer MS ist das Auftreten von sogenannten oligoklonalen IgG-Banden (OKBs). OKBs werden im Liquor von mehr als 95% der MS-Patienten beobachtet, während sie nur sehr selten (<1%) bei gesunden Kontrollen zu finden sind. Außerdem sind diese OKBs auch bei anderen chronischen Erkrankungen des ZNS, die durch einen definierten Erreger verursacht sind, zu beobachten. Bei diesen Erkrankungen ist ein Teil der OKBs gegen das krankheitsverursachende Antigen gerichtet. Trotz intensiver Forschung konnten die Zielantigene der Immunantwort bei MS bisher nicht definiert werden. Ziel dieser Arbeit war es mit einem neuen Ansatz die Zielstrukturen der OKBs bei der MS zu identifizieren. Mit Hilfe eines Protein-Arrays, basierend auf einer cDNA-Bibliothek des menschlichen Gehirns, wurden die Immunreaktivitäten von Liquor-Antikörpern ausgewählter MS-Patienten gegen etwa 37000 verschiedene Proteine bestimmt und mit den Reaktivitäten von Kontroll-Liquores verglichen. Mit Hilfe von anschließenden ELISA-Experimenten mit großen MS- und Kontroll-Kollektiven wurden 10 Proteine identifiziert, die bei MS-Patienten höhere Reaktivitäten zeigten als bei Kontrollen. Interessanterweise wurden in den Immunreaktivitäten gegen diese Kandidatenantigene Überlappungen beobachtet, die letztendlich zu zwei Proteingruppen führten. Mit beiden wurde eine ausgedehnte Epitop-Suche durchgeführt. Die Analysen führten schließlich zu zwei Proteinen des Epstein-Barr-Virus (EBV). Es handelte sich dabei um das EBNA-1 und BRRF-2 Protein. Die weiterführenden Experimente zeigten, dass die Immunreaktivitäten gegen diese EBV-Proteine im Serum und Liquor von MS-Patienten höher waren als bei Patienten mit nicht-entzündlichen bzw. mit anderen entzündlichen Erkrankungen des ZNS. Des Weiteren konnte die intrathekale Synthese der EBV-spezifischen Antikörper gezeigt werden. Von besonderer Bedeutung war der Befund, dass die OKBs im Liquor von MS-Patienten spezifisch gegen diese EBV-Proteine gerichtet waren und Teil des gesamten OKB-Musters darstellten. Diese Ergebnisse unterstützen nachdrücklich die Rolle von EBV in der Pathogenese der MS

Die molekulare Logik der nichtribosomalen Peptidsynthetasen: Identifizierung und biochemische Charakterisierung der Biosynthesegene für Gramicidin A

Gramicidin ist ein Polypeptid, das aus 15 hydrophoben Aminosäuren mit alternierender L-D-Konfiguration besteht. In vivo bilden sich Homodimere, die in Membranen als Ionenkanäle fungieren. Die Primärstruktur von Gramicidin A lautet Formyl-Val1-Gly2-Ala3-DLeu4-Ala5-DVal6-Val7-DVal8-Trp9-DLeu10-Trp11-DLeu12-Trp13-DLeu14-Trp15-Ethanolamin. Das Peptid ist am N Terminus durch N Formylierung und am C Terminus durch Ethanolamin vor Abbau geschützt. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Genkluster von 61 kb aus B. brevis ATCC 8185 mit Hilfe einer Fosmid-Genbank identifiziert und vollständig sequenziert, der für die Gramicidin A - nichtribosomale Peptidsynthetase (NRPS) kodiert. Ein Multienzym-komplex bestehend aus den 4 NRPS LgrABCD mit jeweils 2, 4, 6 und 4 Modulen konnte für Aufbau und Modifizierung des Pentadekapeptids charakterisiert werden. In silico Untersuchungen zur Definition der Substratspezifität aller 16 Module wurde durch biochemische Untersuchungen an drei Adenylierungsdomänen (LgrA1, LgrA2 und LgrB1) gestützt. Damit konnte das Kolinearitätsprinzip dieser NRPS bewiesen werden. Die putative C-terminale Reduktase (R) – Domäne, die an Modul 16 fusioniert ist, deutete auf die Freisetzung des N-formylierten Peptidsubstrats als Alkohol hin. Biochemische Untersuchungen an der rekombinanten R-Domäne mit Peptidyl-Substratvarianten haben gezeigt, daß diese eine ein-Schritt-Reduktion unter NAD(P)H-Verbrauch zum Aldehyd-Intermediat durchführt. Durch die Verwendung von verschiedenen Substrat-Varianten konnte weiter gezeigt werden, daß die R Domäne eine breite Substrattoleranz besitzt. Die Suche nach einer zweiten Reduktase, die das Peptidyl-Aldehyd zum Endprodukt Peptidyl-Ethanolamin umsetzt, hat zur Entdeckung der Aldoreduktase LgrE geführt. In gekoppelten Assays mit beiden rekombinanten Reduktasen konnte das Peptidyl-Ethanolamin produziert werden. Durch in vitro Umsetzung des enzymatisch hergestellten Peptidyl-Aldehyd-Intermediats mit LgrE konnte die strikte NADPH-Abhängigkeit dieses Enzyms gezeigt werden. Die Aldoreduktase wies im direkten Vergleich zur R Domäne eine stringentere Substratspezifität auf. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde eine Methode für Modulaustausche in NRPS auf genetischer Ebene entwickelt. Dabei wird zunächst ein Genfragment gekoppelt an einen Marker ins Genom durch homologe Rekombination eingebracht. Im zweiten Schritt wird der Marker über direct repeats durch Ausloopen wieder entfernt. Das Genfragment bleibt erhalten, und das neue NRPS-Produkt kann analysiert werden

Identifizierung und Charakterisierung zweier für die Produktion extrazellulärer Glykolipide verantwortlichen Gencluster in U. maydis

Ustilago maydis produziert unter Stickstoffmangelbedingungen große Mengen an extrazellulären Glykolipiden, das Cellobioselipid Ustilaginsäure und das Mannosylerythritollipid (Ustilipid). In dieser Arbeit wurden die Biosynthesewege und die biologischen Funktionen beider Glykolipide charakterisiert. Zu diesem Zweck wurden Deletionsmutanten hergestellt, die einen Defekt in der Glykolipid-Produktion aufwiesen. Es konnte die Glykosyltransferase Emt1 identifiziert werden, die für die Produktion von Ustilipiden (MELs) essentiell ist. Aufgund der spezifischen Induktion von Emt1 unter Stickstoffmangelbedingungen konnten durch Microarray-Analysen ein Gen-Cluster in Ustilago maydis identifiziert werden, das für die MEL-Biosynthese verantwortlich ist. Dieses MEL-Cluster besteht aus fünf Genen, denen eine Funktion in der Biosynthese zugeordnet werden konnte. Für die Acetyltransferase Mat1 konnte die vorhergesagte Funktion durch einen Enzymassay und massenspektrometrische Messungen bestätigt werden. Durch die Microarray-Analysen konnte auch ein Ustilaginsäure-Cluster und eine weitere Glykosyltransferase (Hgt1) in diesem Cluster identifiziert werden. Beiden Glykolipiden konnten unterschiedliche biologische Funktionen zugeordnet werden. Es zeigte sich, dass die Ustilaginsäuren wichtig für die Pheromonwahrnehmung sind, und dass sie eine toxische Wirkung gegenüber anderen Mikroorganismen besitzen. Die Ustilipide sind besonders starke oberflächenaktive Substanzen und weisen hämolytische Aktivität auf

In vivo-Untersuchungen von Konformations-Änderungen der Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Nicotiana tabacum

Ziel dieser Arbeit war die Detektion von Konformations-Änderungen der Calcium-abhängigen Protein-Kinase NtCDPK2 aus Tabak (Nicotiana tabacum), die in Abhängigkeit eines Stress-Stimulus induziert werden. Da bislang weder Röntgen- noch NMR-Strukturen für ein Gesamt-Protein einer CDPK bekannt sind, sollten mit verschiedenen in vivo-Methoden Hinweise auf den biochemischen Reaktions-Mechanismus gesammelt werden. Hierzu wurden zum einen intermolekulare Interaktionen einzelner CDPK-Domänen mit dem bereits in Hefe etablierten Split-Ubiquitin (SplitUB) System in trans untersucht. Zum anderen wurde das System auch für eine durch Agrobacterium tumefaciens vermittelte, transiente Expression in der Tabak-Art Nicotiana benthamiana weiterentwickelt und erfolgreich angewandt. Dabei konnte eine Interaktion der Calmodulin-ähnlichen Domäne (CLD) mit der autoinhibitorischen Junction-Domäne (J) der CDPK nachgewiesen werden. Auch das System der "Bimolecular Fluorescence Complementation" wurde für die transiente Expression in N. benthamiana weiterentwickelt und konnte Interaktionen der N-terminalen Domänen (VKJ) mit der CLD nachweisen. Aufgrund stärkerer Hintergrund-Fluoreszenz konnte diese Methode nur Hinweise auf eine mögliche Stimulus-Abhängigkeit der Interaktionen liefern. Neben den intermolekularen Wechselwirkungen wurden auch intramolekulare Interaktionen und somit die Gesamt-Konformation von Proteinen analysiert. Die hierzu verwendete Methode des "Fluorescence Resonance Energy Transfer" (FRET) in cis konnte eine Abhängigkeit der Konformation von der Struktur der Junction-Domäne in planta nachweisen. Zudem wurde das SplitUB-System in cis für die Anwendung in Pflanze weiterentwickelt. Hiermit konnte durch Analysen mutierter Formen von NtCDPK2 eine Abhängigkeit der Konformation von einer biologischen Funktionalität sowohl der Kinase-Domäne als auch von J aufgezeigt werden. Ebenso spielte die Calcium-Affinität der in der CLD lokalisierten EF-Hände eine zentrale Rolle. Diese Ergebnisse vervollständigten ein in der Literatur diskutiertes Aktivierungs-Modell für CDPKs. Aufgrund einer hohen Hintergrund-Abspaltung des Reporters konnten jedoch keine Aussagen über schnelle, dynamische Prozesse wie z.B. nach einer Stimulus-induzierten, transienten Aktivierung des Enzyms getroffen werden. Das SplitUB-System wurde auch für Untersuchungen von Licht-abhängigen Konformations-Änderungen am Beispiel des Cryptochroms AtCRY2 aus Arabidopsis thaliana angewandt. Dieser UV-A- und Blaulicht-Rezeptor ließ einen eindeutigeren Nachweis erwarten, da eine konstante Aktivierung des Enzyms durch Lichteinstrahlung postuliert wird. Es konnte in dieser Arbeit erstmals die Licht-abhängige Konformations-Änderung eines Cryptochroms in vivo nachgewiesen werden. Das SplitUB-System erlaubte es hierbei im Gegensatz zu Untersuchungen an NtCDPK2, auch reziproke und dynamische Unterschiede nach Übergang in Dauerlicht- oder Dauerdunkel-Bedingungen zu detektieren

Allgemeine und funktionelle Untersuchungen zur großen Untereinheit des humanen Replikationsfaktors C (RFC1), sowie initiale Untersuchungen zur Regulation der Expression von RFC1 durch das BCR-ABLp210-Onkogen

In der vorliegenden Arbeit wurden allgemeine und funktionelle Untersuchungen zur großen Untereinheit des humanen Replikationsfaktors C (RFC1) durchgeführt. RFC1 ist als Untereinheit des heteropentameren RFC-Komplexes essentiell an der ATP-abhängigen Beladung des Prozessivitätsfaktors PCNA (Proliferating cell nuclear antigen) an 3Ž-Enden von Primer/Template-Strukturen im Rahmen der DNA-Replikation, wie auch an PCNA-vermittelten DNA-Reparaturprozessen beteiligt. Neben diesen gut charakterisierten Funktionen als essentieller DNA-Replikations- und Reparaturfaktor weisen vereinzelte Untersuchungen auf eine Funktion von RFC1 als transkriptionellen Cofaktor hin, wobei jedoch die funktionelle Bedeutung dieser Beobachtungen in den meisten Fällen bisher nicht näher charakterisiert wurde. Zu Beginn der Arbeit vorliegende Daten ließen auf eine primär transkriptionell regulierte Expression von RFC1 schließen. Die Ergebnisse verschiedener Untersuchungen zur mRNA-Expression von RFC1 bzw. des murinen mRFC1-Gens in untersch

Radiometrische Kalibrierung einer Spiegelreflexkamera

Die Leuchtdichte spielt in der Lichttechnik eine zentrale Rolle. Die korrekte Bestimmung der Leuchtdichte ist wichtig, allerdings messtechnisch anspruchsvoll. Die Arbeit beschreibt die Kalibrierung einer handelsüblichen CCD-Spiegelreflexkamera, um mit dieser Leuchtdichtemessungen durchführen zu können. Für die Kalibrierung wird zunächst eine Ulbricht-Kugel mit Hilfe eines Radiospektrometers charakterisiert. Anschließend werden Bilder der strahlenden Fläche der Ulbricht-Kugel bei verschiedenen Leuchtdichten und unterschiedlichen Kameraeinstellungen aufgenommen. Daraus kann der Zusammenhang zwischen Leuchtdichte und Grauwert des aufgenommenen Bildes hergestellt werden und eine Formel zur Berechnung der Leuchtdichte aus dem Grauwert ist bestimmbar. Um die Bilder bequem auswerten zu können, wird ein Programm unter Visual Basic geschrieben. Das Programm bestimmt die Leuchtdichte für alle Pixel im Bild und stellt das Bild anschließend für mehrere Leuchtdichtebereiche in Falschfarben dar. Mit dem Mauszeiger kann der Grauwert und die Leuchtdichte punktuell abgerufen werden. Zudem berechnet das Programm aus einem manuell eingegebenen Grauwert die Leuchtdichte. Eine Anzeige in Originalgröße oder eine Ausschnittvergrößerung des Bildes sind möglich. Zur Anzeige der Leuchtdichte stehen drei verschiedene Skalen zur Verfügung.Luminance plays a central role in photometry. The precise measurement of luminance is important but rather demanding. In this paper the calibration of a standard CCD-reflex camera is described so that luminance measurements can be performed. For the calibration an Ulbricht-sphere has been characterized by means of a radiospectrometer. Here after pictures with different luminance levels have been taken at various camera settings. Hereby the relation between luminance and grey value can be determined and a formula for calculating the luminance can be derived. For the comfortable analysis of the pictures a comfortable software tool has been written. The program determines the luminance for each pixel within the picture and displays it in false colours for several luminance ranges. By means of the mouse pointer the grey value and luminance of each pixel can be displayed. In addition the program calculates the luminance for a manually entered grey value. An overall view in original size and a display of zoomed detail is both possible. The luminance can be displayed in three different scales

Multiallelic recognition: Nonself-dependent dimerization of the bE and bW homeodomain proteins in ustilago maydis

AbstractIn the plant pathogenic fungus Ustilago maydis, sexual and pathogenic development are controlled by the multiallelic b mating-type locus. The b locus encodes a pair of unrelated homeodomain proteins termed bE and bW, with allelic differences clustering in the N-terminal domains of both polypeptides. Only combinations of bE and bW of different allelic origin are active. We have investigated the underlying molecular mechanism for this intracellular self/nonself recognition phenomenon. By using the two-hybrid system, we were able to show that bE and bW dimerize only if they are derived from different alleles. Dimerization involves the N-terminal variable domains. Different point mutants of bE2 were isolated that function in combination with bW2. The majority of such bE2 mutant polypeptides were also able to form heterodimers with bW2 in the two-hybrid system. Nonself-dependent dimerization of bE and bW was supported with a biochemical interaction assay with immobilized proteins. Our results suggest a model for self/nonself recognition in which variable cohesive contacts direct dimerization