Clinical trials with amniotic membrane mesenchymal stem cells for chronic kidney failure in cat model

A insuficiência renal crônica (IRC) é uma afecção clínica frequente em gatos domésticos. É caracterizada por inflamação tubulointersticial, vascular, glomerular e fibrose severa. Estudos em modelos de IRC induzida em roedores têm revelado uma redução e estabilização do quadro clínico, evidenciados pela melhora nos parâmetros de função renal e redução da inflamação e da fibrose renal. Neste estudo foi testada a segurança e o efeito do transplante alogênico intra-renal e endovenosa das células-tronco mesenquimais derivadas da membrana amniótica felina (AMSCs) em gatos acometidos pela IRC natural. As AMSCs foram isoladas de âmnio de embriões coletadas em campanhas rotineiras de castração. Dez gatos, machos e fêmeas, foram incluídos neste estudo. Um gato hígido recebeu injeção intra-renal das AMSCs guiada por ultrassom em ambos rins (5x105 células/rim). Nove gatos com IRC natural receberam injeção endovenosa das AMSCs (2x106 células x 2 tratamentos). A avaliação da evolução clínica foi baseada na mensuração dos parâmetros do hemograma, bioquímica, hemogasometria, urinálise e ultrassonografia. Foi efetuada análise de variância (ANOVA) comparar diferenças entre as fases de tratamento seguido de teste de Tukey para comparação das médias entre os grupos. Na injeção intra-renal, não houve variação nos parâmetros clínicos, porém foi necessária a sedação e anestesia geral. Foi registrado elevado estresse de manipulação e ligeira hematúria após o procedimento. Os gatos com IRC que receberam injeção endovenosa das AMSCs, registraram uma variação significativa nos parâmetros de função renal (redução dos níveis de creatinina sérica, redução da proteinúria e aumento da densidade urinária). A arquitetura e morfologia renal não teve variação com o tratamento. Conclui-se que as AMSCs felinas têm um efeito renoprotetor e melhoram a função renal em gatos acometidos pela IRC, estabilizando o quadro clínico e a progressão da doença. A injeção endovenosa das AMSCs constitui uma ferramenta importante para proporcionar boa qualidade de vida aos gatos com IRCChronic kidney disease (CKD) is a common clinical condition in domestic cats. It is characterized by tubulointerstitial, vascular, glomerular inflammation and severe fibrosis. Studies in rodent model of induced CKD have been shown a decrease and stabilization of the clinical condition, evidenced by renal function improvement and by inflammation and renal fibrosis reduction. In this study was evaluated the safety and effect of intra-renal and intravenous infusion of allogeneic mesenchymal stem cells derived from feline amniotic membrane (AMSCs) in cats with naturally occurring CKD. The AMSCs were isolated from fetal membranes collected after routine castrations. Ten cats, male and female, were enrolled and included in this study. A healthy cat received intrarenal injection of AMSCs guided by ultrasound in both kidneys (5x105 cells/kidney). Nine cats with naturally CDK received intravenous injection of AMSCs (2x106 cells x 2 treatments). The evaluation of the clinical condition was based on the measurement of complete blood count, blood biochemistry, blood gases, urinalysis and ultrasound. Analysis of variance (ANOVA) was performed to compare differences between the phases of treatment followed by Tukey test to compare means between groups. The clinical parameters of the healthy cat (intrarenal injection) did not change, but sedation and general anesthesia was required. The number of interventions stressed the animal and he developed transient hematuria after AMSCs injection. Cats with CDK, registered a significant improvement of renal function (decrease in serum creatinine and urine protein concentrations and increase in urine specific gravity). The kidney architecture and morphology did not change with the treatment. We conclude that the feline AMSCs have a renoprotective effect and improve renal function in cats with naturally occurring CKD, stabilizing the clinical condition and disease progression. Intravenous injection of AMSCs is an important tool to provide general well-being for cats with CD

Isolation and characterization of Mesenchymal cells from cat amniotic membrane

As células tronco mesenquimais derivadas do âmnio (AMSCs) são células multipotentes com alto potencial para se diferenciar em múltiplas linhagens. Podem ser isoladas sem recurso a procedimentos invasivos e usadas sem levantar quaisquer implicações éticas. O presente estudo visa isolar e caracterizar as células mesenquimais progenitoras da membrana amniótica de gatos domésticos para futura aplicação em terapia celular. As células foram isoladas de quatro membranas fetais, coletadas durante as campanhas rotineiras de castração em gatas no último terço de gestação, após anestesia geral. A porção dorsal do âmnio foi separada mecanicamente, lavada com PBS e submetida à digestão com colagenase. As células coletadas foram propagadas em cultivo (DMEN-F12/-MEM) e criopreservadas em várias passagens enquanto se efetuava a avaliação da cinética de crescimento e das características morfológicas. Em cultivo, as AMSCs demonstraram aderência à placa e uma morfologia similar a dos fibroblastos. A análise imunofenotípica revelou presença de marcadores específicos de MSCs CD73 e CD90 e ausência de marcadores hematopoiéticos CD34, CD45 e CD79 sugerindo a presença de células mesenquimais multipotentes na membrana amniótica de gatos domésticos. Em condições apropriadas, estas células diferenciaram-se em linhagens específicas osteogênica e adipogênica. Entretanto, após inoculação em camundongos imunodeficientes não foi registrado formação de teratomas. Estes achados sugerem que o âmnio de gatos domésticos pode ser considerado uma importante fonte de MSCs com maior atração para medicina regenerativa.The amnion derived mesenchymal stem cells (AMSCs) are multipotent cells with a high ability to differentiate into multiple lineages. They can be obtained by non-invasive methods and therefore are exempt from the normal ethical problems involving stem cell use. The aim of this study was to isolate and characterize the progenitor mesenchymal cells from the cat amniotic membrane for future application in cell therapy. The cells were isolated from four fetal membranes collected after a routine ovarian hysterectomy process from cats in their third gestational trimester, under general anesthesia. The dorsal portion of amnion was mechanically separated, washed with PBS and subjected to collagenase digestion. The isolated cells were propagated in culture media (DMEMF12 or -MEM) and frozen in various passages while the growing kinetics and cell morphology were analyzed. In culture medium, AMSCs were adherent to the plastic culture dish and had a morphology similar to fibroblasts. Immunophenotyping assays showed the presence of MSCs specific markers CD73 and CD90 and absence of hematopoietic markers CD34, CD45 and CD79 suggesting the presence of multipotent mesenchymal cells in the cat amniotic membrane. Under appropriate conditions, these cells differentiated into osteogenic and adipogenic cell lineages. Moreover, after injection into immunodeficient mice, no tumors were generated. These findings suggest that the cat amniotic membrane can be considered an important and useful source of MSCs for regenerative medicine