Update on the Immune Mechanisms Against Respiratory Pathogens

Respiratory infections pose a continuous threat to humans due to their easy dissemination via aerial transmission. As a consequence, they are leading causes of mortality and morbidity worldwide. Lower respiratory tract infections (LRTI) remained the deadliest communicable diseases causing 3 million deaths worldwide in 2016 (1). Similarly, although the number of tuberculosis (TB) deaths tends to decrease, it is still among the top 10 causes of global mortality with a yearly death burden of about 1.6 million (2). The growing emergence of bacterial antibiotic resistance is a major global challenge for the coming years, and several major respiratory pathogens are included in the WHO priority list of bacteria for which new antibiotics are urgently needed (3). In terms of target population, children under the age of five are the most susceptible hosts to a plethora of respiratory pathogens

Update on TB vaccine pipeline

In addition to antibiotics, vaccination is considered among the most efficacious methods in the control and the potential eradication of infectious diseases. New safe and effective vaccines against tuberculosis (TB) could be a very important tool and are called to play a significant role in the fight against TB resistant to antimicrobials. Despite the extended use of the current TB vaccine Bacillus Calmette-Guerin (BCG), TB continues to be transmitted actively and continues to be one of the 10 most important causes of death in the world. In the last 20 years, different TB vaccines have entered clinical trials. In this paper, we review the current use of BCG and the diversity of vaccines in clinical trials and their possible indications. New TB vaccines capable of protecting against respiratory forms of the disease caused by sensitive or resistant Mycobacterium tuberculosis strains would be extremely useful tools helping to prevent the emergence of multi-drug resistance

MTBVAC from discovery to clinical trials in tuberculosis-endemic countries

Introduction: BCG remains the only vaccine against tuberculosis (TB) in use today and despite its impressive global coverage, the nature of BCG protection against the pulmonary forms of TB remains subject to ongoing debate. Because of the limitations of BCG, novel TB vaccine candidates have been developed and several have reached the clinical pipeline. One of these candidates is MTBVAC, the first and only TB vaccine in the clinical pipeline to date based on live-attenuated Mycobacterium tuberculosis that has successfully entered clinical evaluation, a historic milestone in human vaccinology. Areas covered: This review describes development of MTBVAC from discovery to clinical development in high burden TB-endemic countries. The preclinical experiments where MTBVAC has shown to confer improved safety and efficacy over BCG are presented and the clinical development plans for MTBVAC are revealed. The search of all supportive literature in this manuscript was carried out via Pubmed. Expert commentary: Small experimental medicine trials in humans and preclinical efficacy studies with a strong immunological component mimicking clinical trial design are considered essential by the scientific community to help identify reliable vaccine-specific correlates of protection in order to support and accelerate community-wide efficacy trials of new TB vaccines

Construction and characterization of live attenuated vaccines in modem lieages of Mycobacterium tuberculosis based on phoP an fadD26 deletions

Tuberculosis es la enfermedad más devastadora producida por un único agente infeccioso. Mycobacterium tuberculosis, el principal agente causal de la tuberculosis en humanos, se transmite entre humanos por el aire. Se estima que en 2017, 1.3 millones de personas (HIV-negativas) murieron a causa de la tuberculosis además de 300, 000 muertes en personas con HIV y se estima que hubo 10 millones de nuevos casos de tuberculosis.A pesar de la existencia de una vacuna preventiva, BCG, con una amplia cobertura de casi el 90% y la disponibilidad de antibióticos para el tratamiento de la tuberculosis, el aumento de cepas resistentes a los antibióticos y la variable eficacia de protección de BCG frente a la tuberculosis pulmonar hace que esta enfermedad sea la primera causa de muerte debido a un agente infeccioso en la actualidad.Para superar este problema, varios nuevos candidatos a vacuna están siendo desarrollados para obtener una vacuna más eficaz. Una de ellas es MTBVAC, una vacuna viva atenuada basada en deleciones en los genes phoP y fadD26 en un aislado clínico perteneciente al linaje 4 de M. tuberculosis. Ambos genes son importantes factores de virulencia de M. tuberculosis.Las micobacterias adaptadas a infectar a humanos presentan una distribución geográfica específica. Son clasificados en siete linajes que pueden diferenciarse entre “modernos” o “ancestrales” basándonos en la deleción TbD1. Los linajes 2, 3 y 4 de M. tuberculosis son los linajes modernos mientras que los linajes 1 y 7 de M. tuberculosis y los linajes 5 y 6 de Mycobacterium africanum son los linajes denominados ancestrales. Los linajes más ampliamente distribuidos son los linajes 2 y 4 de M. tuberculosis seguido de los linajes 1 y 3 de M. tuberculosis con una distribución intermedia y los otros linajes están presentes en determinadas zonas.Teniendo en cuenta que MTBVAC se obtuvo en un aislado clínico del linaje 4 de M. tuberculosis, las mismas deleciones que en MTBVAC en los genes phoP y fadD26 fueron obtenidas en dos aislados clínicos de M. tuberculosis de los linajes 2 y 3, denominadas MTBVAC-L2 y MTBVAC-L3. Para obtener las deleciones se utilizaron dos estrategias diferentes de ingeniería genética. Por lo tanto, estas tres vacunas candidatas basadas en las deleciones de phoP y fadD26 obtenidas en los linajes modernos de M. tuberculosis, permiten la evaluación de la protección dependiente de linaje. Se realizaron análisis de Western-blot y qRT-PCR de los nuevos mutantes dobles para confirmar los fenotipos dependientes de PhoP y FadD26 que han sido descritos previamente en MTBVAC.Se realizó la caracterización preclínica de experimentos de seguridad y eficacia de protección en el modelo de ratón. En experimentos de seguridad, tanto MTBVAC-L2 como MTBVAC-L3 mostraron atenuación, menor que MTBVAC, siendo solo MTBVAC más atenuada que BCG Pasteur en ratones SCID. Para la evaluación de la eficacia en la protección, grupos de ratones fueron vacunados con MTBVAC, MTBVAC-L2, MTBVAC-L3, BCG Pasteur o no vacunados como control. Se evaluó la carga bacteriana en pulmones y bazo en estudios de protección frente a cepas virulentas de los linajes 2, 3 o 4 de M. tuberculosis. MTBVAC, MTBVAC-L2 and MTBVAC-L3 confirieron protección frente a las cepas modernas utilizadas para el desafío sin diferencias significativas entre ellas. Cabe destacar que las cepas MTBVAC y MTBVAC-L2 confirieron una mayor protección frente a la cepa del linaje 2-Beijijng en comparación con BCG Pasteur. Estos resultados sugirieron protección independiente de linaje en ratones y refuerza el conocimiento previo sobre la eficacia de protección de MTBVAC en varios modelos animales.Con objeto de profundizar con la caracterización de MTBVAC, tras estudio de genómica, transcriptómica y proteómica, nos enfocamos en el estudio de metabolitos producidos diferencialmente por MTBVAC. Se observó que la producción del metabolito di-AMP-cíclico (c-di-AMP) era dependiente de PhoPR. El mutante phoPR en H37Rv producía mayor cantidad de c-di-AMP que la cepa silvestre. La secreción del metabolito se observó solo en el mutante phoPR. También se observó una mayor producción y secreción de c-di-AMP en MTBVAC en comparación con la cepa silvestre.El c-di-AMP es un segundo mensajero que está descrito su involucración en diferentes procesos en bacterias. En M. tuberculosis, el c-di-AMP bacteriano es capaz de desencadenar la respuesta de interferón de tipo I (IFN-β) mediante activación del sensor eucariótico STING. Para evaluar si el c-di-AMP de MTBVAC activa esta respuesta en el hospedador, se obtuvieron deleciones en MTBVAC en los genes que codifican para la ciclasa y la fosfodiesterasa del c-di-AMP. Por lo tanto, se obtuvieron tres cepas diferentes de MTBVAC con diferentes niveles de c-di-AMP. A pesar de los aumentados niveles de c-di-AMP bacteriano en MTBVAC, no se observó respuesta de IFN-β tras la infección en células THP-1. En cambio, MTBVAC y los mutantes en la ciclasa y fosfodiesterasa del c-di-AMP mostraron respuesta IL-1β.<br /

Fighting antimicrobial resistance in mycobacteria: development of an antivirulence screening platform and a genetic methodology to confirm drug resistance phenotypes

¿RESUMENLa tuberculosis (TB) causó 10,6 millones de nuevos casos y 1,6 millones de muertes en 2021 según datos de la Organización Mundial de la Salud (OMS). Su principal agente causal es un único microorganismo infeccioso denominado Mycobacterium tuberculosis. Si bien existe una vacuna preventiva, la BCG, y hay antibióticos disponibles para el tratamiento de la TB, la protección variable que confiere la BCG contra la TB pulmonar y la aparición y propagación de cepas resistentes a antibióticos de M. tuberculosis en todo el mundo hacen que la TB sea hoy en día la primera causa de muerte por una infección bacteriana.La resistencia a los antimicrobianos es una de las 10 principales amenazas mundiales para la salud pública declaradas por la OMS, y preocupa especialmente en el caso de la TB. El uso inapropiado de los antibióticos disponibles durante décadas ha llevado al surgimiento de cepas de M. tuberculosis multirresistentes (MDR) y extremadamente resistentes a los medicamentos (XDR), en las que las opciones terapéuticas se reducen drásticamente. Para afrontar la problemática de la TB, se están desarrollando diferentes estrategias a nivel mundial: mejorar la prevención de la enfermedad con nuevas vacunas candidatas con mejores eficacias protectoras que la BCG y el desarrollo de nuevos medicamentos para tratar a los pacientes infectados con TB.El descubrimiento de nuevos antibióticos activos contra las formas sensibles y resistentes de la TB en la última década ha aumentado la cartera clínica, y 17 nuevas clases químicas de antibióticos se encuentran actualmente en ensayos clínicos de Fase I y II. Sin embargo, todavía existe una necesidad urgente de desarrollar nuevos antibióticos, pero también nuevas estrategias innovadoras para luchar contra la TB, como terapias dirigidas al huésped, basadas en fagos o en terapias antivirulencia.En esta tesis hemos desarrollado una plataforma de cribado y caracterización para el descubrimiento de nuevos fármacos con actividad inhibitoria contra el sistema PhoPR de M. tuberculosis. El sistema PhoPR es un sistema de dos componentes que regula una gran variedad de fenotipos de virulencia de M. tuberculosis y, en consecuencia, los inhibidores de este sistema podrían ser una estrategia antivirulencia con potencial contra la TB. La plataforma de cribado se ha establecido construyendo un panel de diferentes cepas indicadoras (reporteras) del sistema PhoPR M. tuberculosis. Estas cepas reporteras contienen un plásmido integrado en el que la proteína fluorescente verde está bajo el control de un promotor bien caracterizado regulado por el sistema PhoPR. Para poder tener una visión más amplia de la inhibición del sistema PhoPR, hemos construido un panel de cepas reporteras del sistema PhoPR utilizando diferentes promotores regulados por el sistema PhoPR (mcr7 y pks2) y que han sido introducidos en diferentes cepas de los linajes más extendidos de M. tuberculosis. Los ensayos secundarios desarrollados para caracterizar los posibles inhibidores del sistema PhoPR consisten en una evaluación transcriptómica de diferentes genes del regulón PhoPR (los genes mcr7, pks2, pks3, espA, espC y espD), y una evaluación proteómica de la secreción de diferentes efectores de virulencia (ESAT-6, CFP-10, EspA y EspC). Las cepas indicadoras y los ensayos secundarios se han validado utilizando mutantes isogénicos ¿phoPR y una molécula inhibidora del sistema PhoPR ya descrita en la literatura, llamada etoxzolamida (ETZ).También hemos explorado la posibilidad de utilizar una micobacteria no patógena, Mycobacterium smegmatis, como sustituta de M. tuberculosis para el descubrimiento de inhibidores del sistema PhoPR. Para hacerlo, hemos diseñado una cepa de M. smegmatis con su sistema PhoPR endógeno reemplazado por sistema heterólogo de M. tuberculosis. También hemos construido un mutante ¿phoPR como control del sistema PhoPR inactivo en M. smegmatis. Las cepas reporteras de M. smegmatis portadoras del sistema PhoPR de M. tuberculosis han mostrado resultados preliminares pero prometedores.Aparte de M. tuberculosis, existen otras micobacterias no tuberculosas (NTM) en las que preocupa la problemática de la resistencia antimicrobiana. Entre ellos, Mycobacterium abscessus destaca por su natural y fácil desarrollo de resistencia adquirida a antibióticos. La mayor accesibilidad en los últimos años a la secuenciación de genomas completos permite actualmente la identificación de múltiples polimorfismos de nucleótido único (SNP) potenciales que confieran fenotipos de resistencia a fármacos que deben confirmarse.En esta tesis, también hemos desarrollado una estrategia de ¿código de barras cromosómico¿ específica para establecer asociaciones directas de genotipo-fenotipo entre los SNP y los fenotipos de resistencia a los antibióticos en M. abscessus. Para ello, hemos utilizado la tecnología de recombinación para confirmar la relación genotipo-fenotipo de la mutación atpE D29A y la resistencia a bedaquilina. La tecnología de recombinación nos ha permitido introducir la mutación atpE D29A en la región específica del cromosoma de M. abscessus con el uso de un sustrato de intercambio alélico monocatenario (ssAES) y posteriormente recuperar clones resistentes a la bedaquilina. El uso de ssAES con mutaciones silenciosas adicionales como código de barras que rodea la mutación atpE D29A ha permitido confirmar fácilmente la integración específica de la mutación de interés en el cromosoma de M. abscessus mediate técnicas basadas en PCR. Esta estrategia de ¿código de barras¿ ha sido utilizada con éxito en dos fondos genéticos diferentes de M. abscessus, el aislado clínico M. abscessus SL541 y la cepa referencia de laboratorio ATCC19977. Además, hemos utilizado la estrategia de ¿código de barras¿ para confirmar la asociación de una segunda mutación de resistencia a bedaquilina, la mutación atpE A64P, demostrando la amplia aplicabilidad de esta metodología.SUMMARY Tuberculosis disease (TB) caused 10.6 million new cases and 1.6 million deaths in 2021 according to the data from the World Health Organization (WHO). Its main causative agent is a single infectious microorganism called Mycobacterium tuberculosis. Although there is a preventive vaccine, BCG, and there are antibiotics available for the treatment of TB, the variable protection conferred by BCG against pulmonary TB and the emergence and spread of drug-resistant M. tuberculosis strains all around the world make TB nowadays the first cause of death due to bacterial infection. Antimicrobial resistance is one of the top 10 global public health threats declared by the WHO, and it especially worries in the case of TB. The inappropriate use of antibiotics available for decades has led to the rise of multi-drug resistant and extensively drug resistant strains of M. tuberculosis, in which the therapeutic options are dramatically reduced. To overcome TB problematic there are different strategies being developed globally: improve prevention of the disease with new vaccine candidates with better protective efficacies than BCG, and development of new drugs to treat TB infected patients. The discovery of new antibiotics active against sensitive and resistant forms of TB in the last decade has increased the clinical pipeline, and 17 new chemical classes of antibiotics are currently in Phase I and II clinical trials. However, there is still an urgent need of developing new antibiotics, but also new innovative strategies to fight TB, like host directed, phage or antivirulence based therapies. In this thesis we have developed a platform for screening and characterization of new drugs with inhibitory activity against the PhoPR system of M. tuberculosis. The PhoPR system is a two component system which regulates a variety of virulence phenotypes of M. tuberculosis, and consequently, inhibitors of this system could be a potential antivirulence strategy against TB. The screening platform has been established constructing a panel of different PhoPR M. tuberculosis reporter strains. PhoPR reporter strains contain an integrative plasmid in which the green fluorescent protein is under control of a well characterized promoter regulated by the PhoPR system. In order to have a wider view of PhoPR inhibition, we constructed a panel of PhoPR reporter strains using different PhoPR regulated promoters (mcr7 and pks2) that were introduced into different strains comprising the most widespread lineages of M. tuberculosis (L2 and L4). The secondary assays developed to characterize potential PhoPR inhibitors consist of a transcriptomic evaluation of the PhoPR regulon (mcr7, pks2, pks3, espA, espC and espD genes), and a proteomic evaluation of the secretion of different virulence effectors (ESAT-6, CFP-10, EspA and EspC). The reporter strains and the secondary assays have been validated using isogenic ¿phoPR mutants and a PhoPR inhibitory molecule already described in the literature, named ethoxzolamide (ETZ). We have also explored the possibility of using a non-pathogenic mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, as M. tuberculosis surrogate for the discovery of PhoPR inhibitors. To do so, we have engineered a M. smegmatis strain to replace its endogenous PhoPR system by the heterologous system from M. tuberculosis. We have also constructed a ¿phoPR mutant as control of inactive PhoPR system in M. smegmatis. Reporter strains constructed in the different M. smegmatis strains have demonstrated preliminary but promising results of the reporter plasmids in M. smegmatis strains carrying the PhoPR system from M. tuberculosis. Aside from M. tuberculosis, there are other non-tuberculous mycobacteria (NTM) in which antimicrobial resistance is worrying. Among them, Mycobacterium abscessus stands out because of its natural and easy development of acquired drug resistance. The growing use of Whole Genome Sequencing in the last years has allowed the identification of multiple potential single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring drug resistance phenotypes which need to be experimentally confirmed. In this Thesis we have also developed a targeted chromosomal barcoding strategy to establish direct genotype-phenotype associations between SNPs and antibiotic resistance phenotypes in M. abscessus. To do so, we have used the recombineering technology to confirm the genotype-phenotype relationship of an atpE D29A mutation and bedaquiline resistance. The recombineering technology allowed us to introduce the atpE D29A mutation into its specific loci in the M. abscessus chromosome with the use of a single strand allelic exchange substrate (ssAES) and to subsequently recover bedaquiline resistant clones. The use of ssAES with additional silent barcode mutations surrounding the atpE D29A mutation allowed to easily confirm the specific integration of the mutation of interest into the M. abscessus chromosome using PCR based techniques. This barcoding strategy has been successfully used in two different M. abscessus genetic backgrounds, the clinical isolate M. abscessus SL541 and the laboratory reference strain ATCC19977. Additionally, we have used the barcoding strategy to confirm the association of a second bedaquiline resistance mutation, the atpE A64P, demonstrating the broad applicability of this methodology.<br /

Macrophage-bacteria interactions: a 3D microfluidics-based approach

Las infecciones bacterianas causan numerosas muertes anualmente, por lo que es esencial entender los procesos de infección para desarrollar estrategia de prevención y cura. Habitualmente, los estudios in vitro se realizan con métodos tradicionales que, a pesar de aportar un gran conocimiento, no recrean de manera realista los entornos fisiológicos y los resultados obtenidos no siempre concuerdan con los estudios in vivo. Por tanto, en esta tesis proponemos los dispositivos microfluídicos como un modelo in vitro novedoso para el estudio de estos procesos. La microfluídica permite incorporar tridimensionalidad, flujo y cocultivos, entre otros, para conseguir escenarios más realistas. Dado que las infecciones patógenas son procesos largos de múltiples etapas, en esta tesis, nos hemos centrado en la interacción macrófagos-patógenos.En primer lugar, se estudió la extravasación de monocitos dellumen endotelial a la matriz extracelular. Este proceso es necesario para que las células inmunes alcancen las bacterias. Para ello, se utilizó un dispositivo microfluídico que permitía el desarrollo de un vaso endotelial a través del cual se hacían pasar monocitos, permitiendo la cuantificación de los monocitos adheridos y extravasados al cabo de 24 horas. Se analizó el efecto de estímulos mecánicos en este proceso: la aplicación de flujo oscilatorio y la rigidez del entorno. Se determinó que el flujo aumentaba la integridad de membrana del vaso, dificultando la extravasación de los monocitos. Por otro lado, una mayor rigidez de la matriz extracelular, debido a un aumento en la concentración de colágeno, reduce la integridad de barrera del vaso, aumentando la extravasación de los monocitos.En segundo lugar, se estudió la migración de resultados macrófagos en respuesta a fracciones bacterianas obtenidas de bacterias patógenas, Solmonella typhimurium y Mycobacterium tuberculosis, y no patógenas, Escherichio coli y Mycobocterium smegmotis. Los muestran que los macrófagos migran direccionalmente atraídos hacia las fracciones detodas las bacterias, tanto patógenas, como no patógenas, sugiriendo la existencia de patrones moleculares asociados a patógenos en las moléculas de las muestras. Bacterial infections cause numerous deaths annually, so it is essential to understand the infection processes in order to develop prevention and cure strategies. Usually, in vitro studies are performed with traditional methods that, despite providing great knowledge, do not realistically recreate physiological environments and the results obtained do not always agree with in vivo studies. Therefore, in this thesis we propose microfluidic devices as a novel in vitro model for the study of these processes. Microfluidics allows the incorporation of three-dimensionality, flow and co-cultures, among others, to achieve scenarios that are more realistic. Since pathogenic infections are long multistage processes, in this thesis, we focused on the macrophage-pathogen interaction. First, the extravasation of monocytes from the endothelial lumen into the extracellular matrix was studied. This process is necessary for immune cells to reach bacteria. For this purpose, a microfluidic device was used that allowed the development of an endothelial vessel through which monocytes were passed, allowing the quantification of adherent and extravasated monocytes after 24 hours. The effect of mechanical stimuli on this process was analyzed: the application of oscillatory flow and environmental stiffness. It was determined that flow increased the membrane integrity of the vessel, hindering monocyte extravasation. However, higher stiffness of the extracellular matrix, due to high collagen concentration, reduced the barrier integrity of the vessel, increasing monocyte extravasation. Second, macrophage migration was studied in response to bacterial fractions obtained from pathogenic bacteria, Salmonella typhimurium and Mycobacterium tuberculosis, and non-pathogenic bacteria, Escherichia coli and Mycobacterium smegmatis. The results show that macrophages migrate directionally attracted to fractions of all bacteria, both pathogenic and non-pathogenic, suggesting the existence of pathogen-associated molecular patterns in the sample molecules.<br /

Vacunación frente a tuberculosis

La vacunación con BCG (bacilo Calmette-Guérin) está incluida en el calendario de inmunización al nacimiento en países con alta incidencia de tuberculosis, con una cobertura global cercana al 90%. BCG tiene casi cien años de antigüedad y está basada en una cepa atenuada de Mycobacterium bovis, proporcionando protección contra las formas diseminadas de la enfermedad pero confiriendo una protección muy limitada contra las formas pulmonares de tuberculosis, responsables de su transmisión. Diferentes vacunas profilácticas contra la tuberculosis se encuentran hoy en desarrollo clínico para reemplazar a BCG o para mejorar la protección en individuos ya vacunados con BCG. MTBVAC es la primera y única vacuna candidata basada en una cepa de Mycobacterium tuberculosis atenuada en evaluación clínica. Los planes de desarrollo clínico del MTBVAC se dirigen en primer lugar a la prevención de la tuberculosis en recién nacidos, para reemplazar a BCG, y en segundo lugar en adolescentes y adultos

A microfluidic-based analysis of 3D macrophage migration after stimulation by Mycobacterium, Salmonella and Escherichia

Macrophages play an essential role in the process of recognition and containment of microbial infections. These immune cells are recruited to infectious sites to reach and phagocytose pathogens. Specifically, in this article, bacteria from the genus Mycobacterium, Salmonella and Escherichia, were selected to study the directional macrophage movement towards different bacterial fractions. We recreated a three-dimensional environment in a microfluidic device, using a collagen-based hydrogel that simulates the mechanical microarchitecture associated to the Extra Cellular Matrix (ECM). First, we showed that macrophage migration is affected by the collagen concentration of their environment, migrating greater distances at higher velocities with decreasing collagen concentrations. To recreate the infectious microenvironment, macrophages were exposed to lateral gradients of bacterial fractions obtained from the intracellular pathogens M. tuberculosis and S. typhimurium. Our results showed that macrophages migrated directionally, and in a concentration-dependent manner, towards the sites where bacterial fractions are located, suggesting the presence of attractants molecules in all the samples. We confirmed that purified M. tuberculosis antigens, as ESAT-6 and CFP-10, stimulated macrophage recruitment in our device. Finally, we also observed that macrophages migrate towards fractions from non-pathogenic bacteria, such as M. smegmatis and Escherichia coli. In conclusion, our microfluidic device is a useful tool which opens new perspectives to study the recognition of specific antigens by innate immune cells

In deep study of new tuberculosis vaccine candidates based on phoP and fadD26 mutations

El primer objetivo de este trabajo fue caracterizar las interacciones con el hospedador del nuevo candidato a vacuna viva atenuada contra la tuberculosis, MTBVAC. En este estudio se comparó la proteómica de la fracción secretada de MTBVAC y su cepa parental Mt103 a través de las técnicas de western-blot y electroforesis fluorescente diferencial en dos dimensiones (DiGE). Se obtuvieron dos conjuntos de datos de proteínas secretadas mayoritariamente por MTBVAC o Mt103 respectivamente. Gracias a estos resultados se observó el alto porcentaje de sustratos del sistema de secreción TAT (Twin Arginine Translocation) entre la fracción secretada por MTBVAC, y se pudo confirmar la ausencia de los factores de virulencia ESAT-6 y CFP-10 en dicho secretoma. El tráfico intracelular de MTBVAC fue otro aspecto a estudiar de la interacción del candidato a vacuna con su hospedador. MTBVAC es un mutante doble en los genes phoP y fadD26, por lo que se quiso estudiar también la contribución individual de cada mutación al fenotipo final. Se llevaron a cabo infecciones con las correspondientes cepas GFP+ en dos modelos celulares diferentes: la línea celular de macrófagos alveolares de ratón (MHS) y macrófagos primarios humanos derivados de monocitos (hMDM); los resultados se analizaron mediante técnicas de microscopía. Los resultados obtenidos sugieren que MTBVAC, como cepa atenuada que es, no es capaz de detener la maduración del fagosoma en etapas tempranas del proceso, sin embargo la detiene antes de llegar a la fase lisosomal. Mediante esta estrategia MTBVAC evita ser degradada rápidamente en el fagolisosoma. Sin embargo, debido a haber perdido la habilidad de secretar ESAT-6 y CFP-10, MTBVAC no es capaz de escapar al citosol de la célula hospedadora, presentando un fenotipo de persistencia en el cual MTBVAC está “atrapada” en un estadio endosomal tardío. Las mutaciones en los genes phoP y fadD26 de MTBVAC parecen tener un efecto sinérgico sobre el fenotipo del tráfico intracelular del candidato a vacuna. El segundo objetivo fue el estudio exhaustivo del regulon PhoP para tratar de determinar la señal que activa y modula su expresión. Para ello se utilizaron dos estrategias: i) estudiar la expresión de diferentes genes regulados por PhoP a través de un sistema reportero basado en fusiones genéticas de promotores de dichos genes con la proteína GFP, ii) medida directa de la expresión de varios genes regulados por PhoP a través de la extracción de RNA y la técnica de qRT-PCR. En ambos casos, la cepa parental H37Rv y su mutante phoP fueron expuestos a un ambiente intracelular, bien sometiéndolas a condiciones in vitro que trataban de mimetizar las condiciones intrafagosomales (pH ácido, iones, temperatura, hipoxia, etc.) o bien infectando con dichas cepas células fagocíticas y no fagocíticas. Se eligió el promotor de pks2 como reportero más representativo de la actividad del regulón PhoP, demostrando el importante rol que tiene el pH acido en la activación de dicho regulón. Ninguna de las condiciones probadas muestra una señal única que active el regulón PhoP, sugiriendo que es un proceso multifactorial que tiene lugar durante la entrada de la bacteria al interior del macrófago. Sin embargo, la respuesta del regulón tras la exposición a pH ácido demuestra que el pH es un factor clave en la inducción de los genes regulados por PhoP. Basándonos en los resultados obtenidos, se propone una dinámica de expresión de los genes regulados por PhoP dependiente del tiempo post-infección. Los primeros genes activados por PhoP son aquellos relacionados con el metabolismo lipídico y el estrés oxidativo, probablemente para proteger a la bacteria frente al ambiente hostil del interior del fagosoma. Tras 3-5 días, los genes relacionados con el sistema de secreción ESX-1 son activados y en consecuencia, la bacteria secretará ESAT-6 y CFP-10 induciendo con ello la ruptura del fagosoma y su escape al citosol. A partir de este punto, la actividad del RNA no codificante Mcr7 es altamente inducida por PhoP, lo cual conlleva la inhibición del sistema de secreción TAT y consecuentemente se ve restringida la secreción de los componentes del complejo Antígeno 85 con el objetivo de “esconderse” de la respuesta de la célula hospedadora ahora que la bacteria se encuentra en el citosol. Este mecanismo permite a las bacterias virulentas evadir el control inmunológico del hospedador y en el organismo. El tercer objetivo de la presente tesis fue construir una vacuna hiper atenuada basada en MTBVAC para ser usada en la población con riesgo de inmunosupresión, para la que BCG está contraindicada. Se introdujo una tercera mutación en el gen zmp1 (Rv0198c) de MTBVAC (vacuna viva atenuada con mutaciones en los genes phoP y fadD26) con la intención de hiper atenuar la cepa manteniendo su eficacia protectora frente a tuberculosis. Se usó una estrategia de doble recombinación para generar el triple mutante en los genes phoP, fadD26 y zmp1. Resultados preliminares muestran que el triple mutante no mejora la atenuación, la capacidad de generar respuesta inmunológica o la eficacia protectora de MTBVAC; estudios más exhaustivos en otros modelos animales (cobayas) son necesarios para llegar a alguna conclusión. REFERENCIAS 1. WHO, Global Tuberculosis Control: WHO report 2011. 2011. 2. Russell, D.G., Who puts the tubercle in tuberculosis? Nat Rev Microbiol, 2007. 5(1): p. 39-47. 3. Walters, S.B., et al., The Mycobacterium tuberculosis PhoPR two-component system regulates genes essential for virulence and complex lipid biosynthesis. Mol Microbiol, 2006. 60(2): p. 312-30. 4. Perez, E., et al., An essential role for phoP in Mycobacterium tuberculosis virulence. Mol Microbiol, 2001. 41(1): p. 179-87. 5. Gonzalo Asensio, J., et al., The virulence-associated two-component PhoP-PhoR system controls the biosynthesis of polyketide-derived lipids in Mycobacterium tuberculosis. J Biol Chem, 2006. 281(3): p. 1313-6. 6. Ferrer, N.L., et al., Interactions of attenuated Mycobacterium tuberculosis phoP mutant with human macrophages. PLoS One. 5(9): p. e12978. 7. Sirakova, T.D., et al., The Mycobacterium tuberculosis pks2 gene encodes the synthase for the hepta- and octamethyl-branched fatty acids required for sulfolipid synthesis. J Biol Chem, 2001. 276(20): p. 16833-9. 8. Richter, L., et al., Determination of the minimal acid-inducible promoter region of the lipF gene from Mycobacterium tuberculosis. Gene, 2007. 395(1-2): p. 22-8. 9. Kendall, S.L., et al., The Mycobacterium tuberculosis dosRS two-component system is induced by multiple stresses. Tuberculosis (Edinb), 2004. 84(3-4): p. 247-55. 10. Munoz-Elias, E.J. and J.D. McKinney, Mycobacterium tuberculosis isocitrate lyases 1 and 2 are jointly required for in vivo growth and virulence. Nat Med, 2005. 11(6): p. 638-44. 11. Gonzalo-Asensio, J., et al., PhoP: a missing piece in the intricate puzzle of Mycobacterium tuberculosis virulence. PLoS One, 2008. 3(10): p. e3496. 12. Cardona, P.J., et al., Extended safety studies of the attenuated live tuberculosis vaccine SO2 based on phoP mutant. Vaccine, 2009. 27(18): p. 2499-505. 13. Kamath, A.T., et al., New live mycobacterial vaccines: the Geneva consensus on essential steps towards clinical development. Vaccine, 2005. 23(29): p. 3753-61. 14. Arbues, A., et al., Construction, characterization and preclinical evaluation of MTBVAC, the first live-attenuated M. tuberculosis-based vaccine to enter clinical trials. Vaccine. 31(42): p. 4867-73. 15. Walker, K.B., et al., The second Geneva Consensus: Recommendations for novel live TB vaccines. Vaccine. 28(11): p. 2259-70. 16. Master, S.S., et al., Mycobacterium tuberculosis prevents inflammasome activation. Cell Host Microbe, 2008. 3(4): p. 224-32

Construcción de herramientas genéticas para el estudio del transposón IS6110 de mycobacterium tuberculosis

IS6110 está presente en múltiples copias en la mayoría de las cepas de M. tuberculosis. La variación en el número de copias y la ubicación de este elemento en el genoma de M.tuberculosis hace que sea una herramienta ideal para la tipificación de cepas de M.tuberculosis mediante el polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) ( Hermans et al. 1991; Van Embden et al. 1993 ). La transposición de IS6110 está altamente regulada y puede ser sensible al estado fisiológico de la célula huésped, que a su vez se ve afectada por las condiciones ambientales (Iida, 1983 ). La transposasa (enzima que cataliza la movilización del transposón a otra localización del genoma por mecanismos replicativos o no replicativos de transposición) de IS6110 está codificada por un único marco de lectura, aunque en el genoma de M. tuberculosis aparece anotada en dos genes denominados ORFA y ORFB que solapan parcialmente. La transposasa activa se traduce mediante un cambio en la pauta de lectura provocada por el retroceso del ribosoma en 1 nucleótido en la secuencia heptanucleotida, TTTAAAG, situada dentro de la región de solapamiento entre ORFA y ORFB de IS6110 ( McAdam et al. 1990 ). Los objetivos de este trabajo son i) confirmar que la secuencia wild type de la IS6110 codifica para una transposasa inactiva, impidiendo la transposición y ii) que el cambio en la pauta de lectura en una secuencia determinada permita la traducción de una transposasa activa