Optimization of fast and simple real-time PCR-based method for genotyping the angiotensin converting enzyme-I I/D polymorphism

The insertion or deletion of 288 bp in intron 16 of the gene encoding for angiotensin converting enzyme-I (ACE) was the first genetic variant associated with physical performance and one of the most studied in the past 15 years. Carries of the deletion in one of its alleles may have higher enzyme activity, which may result in a greater vasoconstrictor response. These individuals may also better respond to strength and power training, as carriers of the insertion may have a greater propensity to respond better to the endurance training. Traditionally, to determine an individual genotype (I/I, I/D or D/D) the conventional PCR is the method used. This method involves the PCR reaction and then gel electrophoresis for the visualization of DNA bands indicating the genotype. For use this methodology on a large scale, as seen in association studies, such as those used to evaluate the influence of genetics in sport, this double process of conventional PCR is not time-effective. This paper aims to present an optimized, fast and efficient method for the genotyping of this polymorphism by real-time PCR, using genomic DNA samples collected from buccal cells. The method discussed in the text was originally proposed in 2001, but its original configuration has limitations in its methodology and uses much of the reagent. Thus, protocol variables such as primer concentration, reaction volume and the resolution of dissociation curve which indicates the genotypes were adjusted. After this adjustments the protocol remained effective with a reduced cost, suitable for use in large-scale studies involving genetic and sport.A inserção ou deleção de 288 pb no íntron 16 do gene que codifica a enzima conversora de angiotensina (ECA) foi a primeira variante genética associada com o desempenho físico e uma das mais estudadas nos últimos 15 anos. Carreadores da deleção em pelo menos um dos alelos, podem apresentar maior atividade enzimática, resultando em uma maior resposta vasoconstritora. Estes indivíduos podem também possuir uma melhor resposta ao treinamento de força e potência, assim como carreadores da inserção podem possuir uma melhor predisposição ao treinamento de endurance. Tradicionalmente, para determinar o genótipo do indivíduo (I/I, I/D ou D/D), o método utilizado é o PCR convencional. Este método envolve dois estágios; primeiramente a reação da PCR é realizada e depois o gel de agarose contendo o produto da PCR é submetido à eletroforese tornando possível visualizar por luz UV as bandas de DNA indicando o genótipo. Para o uso desta metodologia em larga escala, como no caso de estudos de associação, utilizados para avaliar a influência da genética no esporte, este duplo processo consumo muito tempo. Este artigo tem como objetivo apresentar um protocolo rápido e eficiente para a genotipagem deste polimorfismo por meio da PCR em tempo real, utilizando DNA genômico coletado de células bucais. O protocolo discutido no texto foi inicialmente proposto em 2001, contudo a sua configuração original apresenta limitações e utiliza uma quantidade grande de material. Variáveis do protocolo, tais como: concentração do primer, volume de reação e resolução da curva de dissociação que indica o genótipo foram ajustadas. Após este ajustamento, o protocolo permaneceu efetivo com uma quantidade reduzida de custo, adequado para o uso em estudos em larga-escala envolvendo genética e esporte