Rapid, Simultaneous Detection of Clostridium sordellii and Clostridium perfringens in Archived Tissues by a Novel PCR-Based Microsphere Assay: Diagnostic Implications for Pregnancy-Associated Toxic Shock Syndrome Cases

Clostridium sordellii and Clostridium perfringens are infrequent human pathogens; however, the case-fatality rates for the infections are very high, particularly in obstetric C. sordellii infections (>90%). Deaths from Clostridium sordellii and Clostridium perfringens toxic shock (CTS) are sudden, and diagnosis is often challenging. Formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissues usually are the only specimens available for sudden fatal cases, and immunohistochemistry (IHC) for Clostridia is generally performed but it cannot identify species. A clear need exists for a rapid, species-specific diagnostic assay for FFPE tissues. We developed a duplex PCR-based microsphere assay for simultaneous detection of C. sordellii and C. perfringens and evaluated DNA extracted from 42 Clostridium isolates and FFPE tissues of 28 patients with toxic shock/endometritis (20 CTS, 8 non-CTS, as confirmed by PCR and sequencing). The microsphere assay correctly identified C. sordellii and C. perfringens in all known isolates and in all CTS patients (10 C. sordellii, 8 C. perfringens, 2 both) and showed 100% concordance with PCR and sequencing results. The microsphere assay is a rapid, specific, and cost-effective method for the diagnosis of CTS and offers the advantage of simultaneous testing for C. sordellii and C. perfringens in FFPE tissues using a limited amount of DNA

Genetic polymorphism and tropism study of HIV-1 strains among seropositive individuals

Phylogenetic trees of the pol sequences obtained in this study with reference sequences indicated that subtypes B and A1 were the most common subtypes present and accounted for 44.9 and 42.9% respectively, followed by subtype C (3.1%), CRF02_AG (4.1%), CRF04_cpx (2.0%), and subtypes CRF01_01, F1 and G (1.0%). A high rate of clustered transmission of subtype A1 resistant strains to reverse transcriptase inhibitors was observed among men having sex with men. Indeed, fifteen out of seventeen study subjects (88.2%) infected with TDR strains were implicated in transmission clusters, ten of whom (66.7%) were men-having-sex with-men (MSM) and also infected with sub-subtype A1 strains. The main cluster within subtype A1 (I) included eight men reporting having sex with men from Thessaloniki infected with dual-class RT resistant strains carrying both T215C and Y181C mutations.In comparison with previous published data in 2002, the prevalence of subtype A1 has significantly increased over the time with an eventually decrease of subtype B (from 1,7% and 98,34% to 42,9% and 44,9% respectively) and also the high risk group of MSM has significantly increased from 31,4% to 75%. As part of the same study, DNA sequences encoding the env (C2-C5 region of gp120) were also amplified from PBMC extracted DNA in order to determine the genotypic co-receptor tropism and genetic subtype. Cellular HIV-1 DNA levels had a median of 3.309 log10 HIV-1 copies per 106 PBMC and demonstrated no correlation between cellular HIV-1 DNA levels and HIV-1 transmitted drug resistance. An absence of association between cellular HIV-1 DNA levels with plasma viral HIV-1 RNA load and CD4 levels was also found. Genotypic analysis of co-receptor tropism indicated that 96% of samples, independently of the presence or not of genotypic drug resistance, were CCR5-tropic. Overall, the findings confirmed that transmitted drug resistance does not impact on disease progression in HIV-1 infected individuals. Also, CCR5 co-receptor tropism dominance suggests that both drug-resistant and drug-sensitive strains behave similarly in early infection in newly diagnosed patients.Δείγματα αίματος 98 νεοδιαγνωσθέντων HIV-1 οροθετικών ατόμων κατά το χρονικό διάστημα 2009 - 2010 εξετάσθηκαν με μεθόδους αλληλούχισης του DNA και φυλογενετικής ανάλυσης της πρωτεάσης και ορισμένων περιοχών της ανάστροφης μεταγραφάσης του γονιδίου Pol και του γονιδίου Env της περιοχής C2 – C5 της γλυκοπρωτεϊνης gp120 του HIV-1.Τα φυλογενετικά δένδρα του γονιδίου Pol, τα οποία κατασκευάστηκαν με τις αλληλουχίες των 98 οροθετικών ατόμων της μελέτης και με αλληλουχίες αναφοράς, έδειξαν ότι οι επικρατέστεροι υπότυποι του HIV-1 ήταν οι υπότυποι B και Α1 με ποσοστά 44,9% και 42,9% αντίστοιχα, ακολουθούμενοι από τούς υπότυπους C (3,1%), CRF02_AG (4,1%), CRF04_cpx (2,0%) και τους υπότυπους CRF01_ 01, F1 και G (1%).Σε σύγκριση με προηγούμενες μελέτες που αφορούσαν την ίδια γεωγραφική περιοχή δεν βρέθηκαν νέοι υπότυποι του ιού αλλά κατά την τελευταία δεκαετία παρατηρήθηκε μία αλλαγή στην επικράτηση των υπότυπων Β και Α1 από 98,3% και 1,7% σε 44,9% και 42,9% αντίστοιχα. Παράλληλα παρατηρήθηκε αύξηση του ποσοστού μόλυνσης της ομάδος υψηλού κινδύνου των ανδρών που ανέφεραν σεξουαλική επαφή με άλλους άνδρες από 31,4% σε 75%.Η συνολική επικράτηση των μεταλλάξεων μεταδιδόμενης αντοχής στα αντιρετροϊκά φάρμακα βρέθηκε 17,4%. Από αυτά τα άτομα το 29,4% μολύνθηκε με στελέχη του HIV-1 τα οποία έφεραν μια μετάλλαξη μεταδιδόμενης αντοχής, το 64,7% δύο και το 5,9% πολλαπλές. Ειδικότερα, η αντοχή έναντι των αναστολέων του νουκλεοσιδίου της ανάστροφης μεταγραφάσης (NRTI) βρέθηκε 12,24%, των αναστολέων της μη-νουκλεσιδικής ανάστροφης μεταγραφάσης (NNRTI) 17,35% και των αναστολέων της πρωτεάσης (PI) 1,02%. Υψηλό ποσοστό συστοιχιών μεταφερόμενης αντοχής του υπότυπου Α1 στους αναστολείς της ανάστροφης μεταγραφάσης παρατηρήθηκε μεταξύ των ανδρών με σεξουαλικές επαφές με άλλους άνδρες. Τα δεκαπέντε (15) από τα δεκαεπτά (17) άτομα της μελέτης (82,8%) μολύνθηκαν με στελέχη μεταφερόμενης αντοχής, τα οποία εμπλέκονταν με συστοιχίες μετάδοσης αντοχής. Από τα 15 άτομα με μεταφερόμενη αντοχή σε συστοιχίες μετάδοσης, δέκα (10) άτομα (66,7%) ήταν άνδρες με σεξουαλική επαφή με άλλους άνδρες οι οποίοι μολύνθηκαν με στελέχη του υπότυπου Α1. Η κύρια συστοιχία του υπότυπου Α1 περιελάμβανε οκτώ άνδρες οι οποίοι ήταν κάτοικοι της Θεσσαλονίκης και ανέφεραν σεξουαλικές επαφές με άλλους άνδρες. Όλα αυτά τα άτομα μολύνθηκαν με στελέχη του ιού Α1, τα οποία μετέφεραν διπλή αντοχή, με μεταλλάξεις T215C και Y181C της ανάστροφης μεταγραφάσης. Επιπλέον, τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης αποδεικνύουν ότι οι οκτώ υπότυποι ( A, B, C, CRF- AG, CRF04-cpx, CRF-01, F1 και G ) οι οποίοι ενδημούν στην Β. Ελλάδα δεν συσχετίζονται με διαφορετικά επίπεδα κυτταρικού DNA του HIV-1 και επίσης ότι τα επίπεδα του κυτταρικού HIV-1 DNA είναι ανεξάρτητα από το HIV-1 RNA (ιϊκό φορτίο) του και του αριθμού των CD4 T λεμφοκυττάρων πλάσματος. Ο μέσος όρος των επιπέδων του κυτταρικού HIV-1 DNA έδειξε ότι δεν υπάρχει συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων του κυτταρικού HIV-1 DNA των οροθετικών ατόμων και της μεταφερόμενης αντοχής στα αντιρετροϊκά φάρμακα. Μεταξύ των 98 νεοδιαγνωσθέντων ατόμων με αντοχή στα φάρμακα και των ατόμων με ευαισθησία σε αυτά δεν υπήρχε σημαντική στατιστική διαφορά του κυτταρικού φορτίου HIV-1 (STS) DNA μεταξύ των δειγμάτων που δεν είχαν μεταλλάξεις αντοχής στα αντιρετροϊκά φάρμακα και των δειγμάτων με μεταλλάξεις αντοχής.Ο γενοτυπικός τροπισμός των συνυποδοχέων του HIV-1 των 98 οροθετικών ατόμων, ο οποίος προσδιορίσθηκε από το κυτταρικό DNA, έδειξε ότι τα περισσότερα δείγματα ήταν CCR5 τροπισμού (95,7%) και τα υπόλοιπα μεικτού τροπισμού CCR5 και CXCR4 (4,3%)

Inhibition of IRF-3 Activation by VP35 Is Critical for the High Level of Virulence of Ebola Virus▿

Zaire ebolavirus causes a rapidly progressing hemorrhagic disease with high mortality. Identification of the viral virulence factors that contribute to the severity of disease induced by Ebola virus is critical for the design of therapeutics and vaccines against the disease. Given the rapidity of disease progression, virus interaction with the innate immune system early in the course of infection likely plays an important role in determining the outcome of the disease. The Ebola virus VP35 protein inhibits the activation of IRF-3, a critical transcription factor for the induction of early antiviral immunity. Previous studies revealed that a single amino acid change (R312A) in VP35 renders the protein unable to inhibit IRF-3 activation. A reverse-genetics-generated, mouse-adapted, recombinant Ebola virus that encodes the R312A mutation in VP35 was produced. We found that relative to the case for wild-type virus containing the authentic VP35 sequence, this single amino acid change in VP35 renders the virus completely attenuated in mice. Given that these viruses differ by only a single amino acid in the IRF-3 inhibitory domain of VP35, the level of alteration of virulence is remarkable and highlights the importance of VP35 for the pathogenesis of Ebola virus