Non-Alcoholic Fatty Liver Disease Induces Signs of Alzheimer’s Disease (AD) in Wild-Type Mice and Accelerates Pathological Signs of AD in an AD Model

Background: Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a chronic liver disease afflicting about one third of the world\u27s population and 30 % of the US population. It is induced by consumption of high-lipid diets and is characterized by liver inflammation and subsequent liver pathology. Obesity and consumption of a high-fat diet are known to increase the risk of Alzheimer\u27s disease (AD). Here, we investigated NAFLD-induced liver inflammation in the pathogenesis of AD. Methods: WT and APP-Tg mice were fed with a standard diet (SD) or a high-fat diet (HFD) for 2, 5 months, or 1 year to induce NAFLD. Another set of APP-Tg mice were removed from HFD after 2 months and put back on SD for 3 months. Results: During acute phase NAFLD, WT and APP-Tg mice developed significant liver inflammation and pathology that coincided with increased numbers of activated microglial cells in the brain, increased inflammatory cytokine profile, and increased expression of toll-like receptors. Chronic NAFLD induced advanced pathological signs of AD in both WT and APP-Tg mice, and also induced neuronal apoptosis. We observed decreased brain expression of low-density lipoprotein receptor-related protein-1 (LRP-1) which is involved in β-amyloid clearance, in both WT and APP-Tg mice after ongoing administration of the HFD. LRP-1 expression correlated with advanced signs of AD over the course of chronic NAFLD. Removal of mice from HFD during acute NAFLD reversed liver pathology, decreased signs of activated microglial cells and neuro-inflammation, and decreased β-amyloid plaque load. Conclusions: Our findings indicate that chronic inflammation induced outside the brain is sufficient to induce neurodegeneration in the absence of genetic predisposition

Die pathologische Rolle von Synphilin-1 und das therapeutische Potential von Hsp70 in Modellen der Parkinsonkrankheit unter Verwendung viraler Vektoren

The core characteristics of Parkinson’s disease (PD) are the loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (SNc) leading to depletion of striatal dopamine levels, and the presence of intraneuronal proteinaceous cytoplasmatic inclusions, designated “Lewy bodies” (LB). We first tried to provide new mechanistic insights in the pathogenesis of PD. Next, we went on testing a therapeutic approach based on viral vector mediated gene transfer of Hsp70 in several models of PD. Synphilin-1 is commonly found in LB and was described as a protein interacting with allphasynuclein the main constituent of LBs. Our group has previously described and characterized in vitro a mutation in the synphilin-1 gene (R621C) in PD patients. To provide the first characterization of synphilin-1 expression in an animal model, we here used adenoviral gene transfer to study the effects of wild-type (WT) and R621C synphilin-1 in DA neurons in mouse brain. Since synphilin-1 is commonly used to trigger aggregation of alpha-synuclein in cell culture, we investigated not only non-transgenic C57Bl/6 mice but also (Thy1)-h[A30P]alpha-synuclein transgenic (A30PalphaSyn) animals. Both WT synphilin-1 and R621C synphilin-1 led to the formation of Thioflavine-S positive inclusions and to the degeneration of DA neurons in the SN in C57Bl/6 mice. R621C synphilin-1 induced more aggregates than WT synphilin-1 in A30P-alpha-synuclein transgenic mice, consistent with the role of the R621C mutation as a susceptibility factor for PD. Synphilin-1 expression may be used to improve current mouse models of PD, since it induced both the formation of aggregates and degeneration of dopaminergic neurons, two core characteristics of Parkinson’s disease that have not been well reproduced with expression of alpha-synuclein. Proteasomal inhibition is thought to be involved in aggregate formation in neurodegenerative diseases like PD. UbG76V-GFP mice transgenic for a GFP reporter carrying a constitutively active degradation signal were crossbred with A30PalphaSyn mice to monitor the status of the ubiquitin/proteasom system in A30PalphaSyn mice. The distribution pattern of GFP-positive cells in the aggregate-affected brain regions did not differ from controls (heterozygous or negative for A30P-alpha-synuclein) at any investigated time point. This suggests that proteasomal impairment unlikely occurs early in disease progression, at least in the investigated paradigm. Even though the initial insult that provokes neurodegeneration in PD remains unclear, oxidative stress and accumulation of misfolded proteins have been identified as critical events. To model PD, oxidative stress can be pharmacologically initiated by the mitochondrial complex I inhibitor MPP+. Protein aggregation is commonly investigated in the context of alpha-synuclein aggregation. To determine the effects of Hsp70 on aggregation and toxicity of alpha-synuclein, HSp70 was coexpressed with deltaC-alpha-synuclein, a variant with abundant aggregate formation and highest toxicity. Hsp70 not only prevented the formation of aggregates, but also increased their reduction and clearance, underlining its therapeutic potential. Interestingly, the prevalence of aggresomes was increased with Hsp70. These findings prompted us to determine, whether Hsp70 can also preserve cellular viability in a toxin-based cell culture model. Hsp70 was induced in SH-SY5Y neuroblastoma cells by adenoviral gene transfer or by administration of geldanamycin, prior to exposure to MPP+. Cell viability was measured by the trypan blue exclusion assay, MPP+ toxicity was assessed by measuring released Lactate dehydrogenase. Both geldanamycin and adenoviral gene transfer reduced MPP+ toxicity and increased cell viability when compared to vehicle treatment. This effect occurs in paradigms with and without caspase activation, suggesting that neuroprotection by Hsp70 most likely results from its effect on oxidized and/or misfolded proteins rather than from caspase inhibition. Thus, we aimed to establish viral vector mediated expression of Hsp70 in the A30PalphaSyn transgenic mice to demonstrate the potency of a chaperone therapy in this mouse model for PD. Because adenoviral vectors have toxic side effect when expressed longer, a lentiviral vector and AAV expressing HA-tagged Hsp70 were evaluated for their capability to reduce the aggregate burden in A30PalphaSyn mice. Lentiviral vectors provided low neuronal transgene expression. AAV improved the neuronal transduction efficiency. However, Hsp70 overexpression was not sufficient to significantly reduce aggregate load in the infected brain area.Hauptkennzeichen der Parkinson-Krankheit (PK) sind der Verlust dopaminerger (DA) Neurone in der Substantia nigra pars compacta (SN), und das Auftreten intraneuronaler proteinhaltiger zytoplasmatischer Einschlüsse, sogenannter Lewy Körperchen (LK). Mit der vorliegenden Arbeit sollten zunächst neue Erkenntnisse zur PK-Pathogenese gewonnen werden; darüber hinaus wurde ein therapeutischer Ansatz basierend auf dem Gentransfer von Hsp70 mittels viraler Vektoren in verschiedenen PK-Modellen getestet. Synphilin-1 ist häufig in LK nachweisbar und wurde als Interaktionspartner von alpha-Synuklein, dem Hauptbestandteil von LK beschrieben. In einer vorausgehenden Studie wurde eine Mutation im Synphilin-1-Gen (R621C) von PK-Patienten in beschrieben und charakterisiert. Um Synphilin-1 im Tiermodel zu charakterisieren, wurde in der vorliegenden Arbeit die Wirkung einer Wildtyp (WT)– bzw. R621C-Synphilin-1-Expression mittels adenoviraler Vektoren in SN-Neuronen der Maus analysiert. Da Synphilin-1 häufig verwendet wird, um die Aggregation von alpha-Synuklein in Zellkultur zu induzieren, wurden nicht nur Wildtyp, sondern auch A30P-alpha-Synuklein transgene (A30PalphaSyn) Tiere untersucht. WT Synphilin-1 und R621C Synphilin-1 lösten die Bildung Thioflavin-S-positiver Einschlüssen und eine Degeneration DA-erger Neurone der SN in C57Bl/6-Mäusen in Wildtyp-Mäusen aus. Übereinstimmend mit seiner Rolle als Suszeptibilitätsfaktor der PK, induzierte R621C-Synphilin-1 mehr Aggregate als WT-Synphilin-1 in A30PalphaSyn transgenen Mäusen. Die Expression von Synphilin-1 könnte künftig genutzt werden, um bereits vorhandene PK-Mausmodelle zu verbessern, da es die beiden Hauptmerkmale der PK, die bisher durch alpha-Synuklein-Expression unzureichend reproduziert werden konnten, auslöst. Die Inhibition des Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) steht im Verdacht, an der Aggregatbildung in neurodegenerativen Erkrankungen wie der PK, beteiligt zu sein. UbG76V-GFP Mäuse, die ein Transgen für ein GFP-Reporterprotein mit konstitutiv aktivem Degradationssignal tragen, wurden mit A30PalphaSyn-Mäusen gekreuzt, um das UPS in A30PalphaSyn-Mäusen zu untersuchen. Junge erwachsene, gealterte presymptomatische und gealterte symptomatische doppelt transgene Mäuse daraufhin untersucht, ob und wann eine UPS-Beeinträchtigung im Verlauf der alpha-Synuklein-Aggregation stattfindet. Das Verteilungsmuster GFP-positiver Zellen in den betroffenen Hirnregionen unterschied sich zu keinem untersuchten Zeitpunkt von den Kontrollen. Daraus schlussfolgerten wir, dass im hier untersuchten Zusammenhang eine Störung des UPS wahrscheinlich kein frühes Ereignis im Krankheitsverlauf ist. Oxidativer Stress und die Akkumulation fehlgefalteter Proteine gelten als kritische Faktoren der PK-Entstehung. Oxidativer Stress kann pharmakologisch durch den mitochondrialen Komplex-I-Inhibitor MPP+ ausgelöst werden. Proteinaggregation wird üblicherweise im Kontext der Aggregation von alpha-Synuklein untersucht. Um die Wirkung von Hsp70 auf Aggregation und Toxizität von alpha-Synuklein zu bestimmen, wurde Hsp70 mit deltaC-alpha-Synuklein ko-exprimiert, einer alpha-Synuklein Variante mit ausgeprägter Aggregatbildung und Toxizität. Hsp70 verhinderte nicht nur die Bildung von Aggregaten, es verstärkte auch ihren Abbau. Interessanterweise erhöhte Hsp70 die Prävalenz von Aggresomen. Aufgrund dieses Befundes wurde desweiteren untersucht, ob Hsp70 auch zum Erhalt der zellulären Viabilität in einem Toxin-basierten PK-Zellkulturmodell beitragen kann. Die Hsp70-Expression wurde in SH-SY5-Neuroblastomzellen durch der MPP+-Exposition vorausgehenden adenoviralen Gentransfer induziert. Die Zellviabilität wurde mittels des Trypanblau-Assays und die MPP+-Toxizität anhand der Freisetzung von LDH bestimmt. Durch Hsp70-Überexpression wurde die MPP+-Toxizität reduziert und die Zellviabilität erhöht. Dieser Effekt trat in experimentellen Ansätzen mit und ohne Caspase-Aktivierung auf. Dies legt nahe, dass die Hsp70-vermittelte Neuroprotektion wahrscheinlich eher auf dessen Chaperone-Wirkung auf oxidierte und/oder fehlgefaltete Proteine, als auf eine Caspase-Inhibierung zurückzuführen ist. Um das Potential einer Chaperone-Therapie in A30PalphaSyn-transgenen Mäusen zu demonstrieren, wurde eine durch virale Vektoren vermittelte Hsp70-Expression im A30PalphaSyn-PK-Mausmodel angestrebt. Da die Adenoviren bei längerer Expression toxische Nebenwirkungen haben, wurde ein lentiviraler und ein Adeno-assoziierter viraler (AAV) Vektor zur Expression von Hsp70 auf seine Eignung, die Aggregatbelastung in A30PalphaSyn-Mäusen zu reduzieren, evaluiert. Lentivirale Vektoren zeigten eine geringe neuronale Transgenexpression. AVV verbesserten die neuronalen Transduktionseffizienz deutlich. Allerdings reichte die Hsp70-Überexpression nicht aus, um die Aggregatlast in den infizierten Hirnregionen signifikant zu reduzieren

Additional file 5: Figure S4. of Non-alcoholic fatty liver disease induces signs of Alzheimer’s disease (AD) in wild-type mice and accelerates pathological signs of AD in an AD model

Positive pixel count of oil O-red staining in the liver of WT and APP-Tg mice fed with SD or HFD for 1 year. Fixed liver sections were stained with oil O-red and positive pixels (red) were counted using Zen Software. **indicates p < 0.01. (two-way ANOVA with Bonferroni post-test, n = 2)

Additional file 2: Figure S1. of Non-alcoholic fatty liver disease induces signs of Alzheimer’s disease (AD) in wild-type mice and accelerates pathological signs of AD in an AD model

Brain sections from SD and HFD-fed WT mice at 2 months stained with Thioflavin S (Green). Sections were counter-stained with DAPI to visualize nuclei. Scale bar = 200 μm