Metabotropic regulation of ATP-gated P2X3 receptors

Among the ATP-gated channels, the P2X3 subtype is exclusively expressed in nociceptors of dorsal root ganglia (DRG) and trigeminal ganglia, where it plays a major role in enhanced pain sensation observed in chronic pain states. We tested the hypothesis that P2X3 receptors are modulated by metabotropic receptors, such as 5-HT2A, mG1uR5 and trkA, leading to increased P2X3-mediated currents. Double fluorescence labeling confirmed that P2X3-expressing neurons are labeled by the lectin IB4 and we showed that 5-HT2A and mGluR5 receptors, but not trkA, are expressed in a fraction of IB4-positive neurons. Using confocal microscopy, we examined the subcellular distribution of P2X3 and we observed that 5-HT induced a translocation of P2X3 labeling in a significant number of neurons. In Xenopus oocytes, we recorded a short-lasting and kinase-dependent potentiation of P2X3 currents by activation of co-expressed 5-HT2A and mGluR5 receptors. The data presented here show that both 5-HT2A and mG1uR5 are potential modulators of P2X3 receptors in a subset of nociceptors in DRG

Spinal opioid-adrenergic analgesic interactions: mechanistic insights on the role of the delta opioid and the alpha2A adrenergic receptors

Opioid and α2-adrenergic receptor (α2AR) ligands are both analgesic when administered spinally and show a clinically beneficial synergistic interaction in the treatment of pain when co-administered. The µ- and δ-opioid receptors (MOR and DOR respectively) and the α2AARs have been shown to be capable of mediating opioid-adrenergic synergistic interactions. The development of new therapeutic approaches that exploit the combination of opioids and α2AR agonists is currently hindered by limited mechanistic knowledge on how these drugs interact at the spinal level. It is generally accepted that MOR mediates morphine antinociception. However, since morphine-related interactions between MOR and DOR have been reported at the spinal level, the role of DOR in spinal morphine antinociception requires further evaluation. Therefore, the First Aim of this thesis was to investigate the role of DOR in the antinociceptive effect of morphine and other opioids at the spinal level. Using the hot water tail flick assay, we observed that morphine was equally potent, but less effective in DOR-knockout (KO) mice compared to wild type (WT) mice. On the other hand, the efficacy of the DOR-selective agonists DeltII and SNC80 was maintained in DOR-KO mice. This study therefore suggests that 1) DOR is necessary to obtain full spinal morphine antinociceptive efficacy and 2) that DOR agonists are not selective in the tail flick assay. These observations from Aim 1 raised two important questions: 1) Is DOR necessary to produce a morphine synergistic interaction with an α2AR agonist? 2) Is DOR activation by DOR agonists sufficient to obtain a synergistic interaction with an α2AR agonist? Thus, the Second Aim of this thesis was to determine whether DOR activation is sufficient and necessary to mediate opioid-adrenergic synergistic interactions in the spinal cord. The absence of DeltII antinociception in DOR-KO mice confirmed its selectivity in the substance P behavioral assay, therefore validating the choice of this assay. Opioid-adrenergic drug interactions were evaluated following spinal co-administration of the α2AR agonist clonidine with DeltII, morphine or DAMGO in WT and DOR-KO mice. Our results showed that DeltII+clonidine synergy is DOR-dependent, morphine+clonidine synergy is not DOR-dependent and DAMGO+clonidine do not interact synergistically. These findings confirm that DOR activation is sufficient but not necessary for synergy with α2AR agonists.The Third Aim of this thesis was to investigate the role of α2AAR in spinal opioid-adrenergic synergy and opioid antinociception. We first confirmed that the α2AAR mediates the synergistic interaction between clonidine and either morphine or DeltII. We also observed a potentiation of spinal morphine and spinal DeltII-mediated antinociception in α2AAR-KO mice compared to WT mice; this potentiation could not be attributed to changes in the expression of opioid receptors, to alterations in opioid ligand binding properties or to enhanced noradrenergic tone in the spinal cord. Together, these findings led us to propose a model whereby the α2AAR allosterically modulates spinal opioid receptors in an activation state-dependent manner. These studies improve our understanding of the interaction between α2-adrenergic and opioid drugs at the spinal level, which could lead to new the development of better pharmacological treatments for pain management.Les ligands des récepteurs opiacés et α2 adrénergiques (α2AR) ont tous deux une action analgésique lorsque administrés par la voie spinale et peuvent démontrer une interaction synergétique cliniquement bénéfique lorsqu'ils sont co-administrés. Il a été démontré que les récepteurs opiacés µ et δ (MOR et DOR, respectivement) et le récepteur α2AAR sont capables de générer des intéractions opiacés-adrénergiques synergétiques. Le développement de nouvelles approches thérapeutiques exploitant ces combinaisons est ralenti par une connaissance limitée des mécanismes régissant les interactions entre ces médicaments. Il est généralement bien accepté que MOR effectue l'antinociception causée par la morphine. Cependant, puisque des interactions entre MOR et DOR médiées par la morphine ont été rapportées dans la moelle épinière, le rôle de DOR dans l'antinociception produite par la morphine requiert une évaluation plus approfondie. Donc, le premier objectif de cette thèse était d'investiguer le rôle que joue DOR dans l'effet antinociceptif de la morphine et d'autres opiacés au niveau spinal. Avec le test d'immersion de la queue en eau chaude, nous avons observé que la morphine était aussi puissante, mais moins efficace chez les souris DOR-knockout (KO) que chez les souris de type sauvage (TS). D'autre part, l'efficacité des agonistes sélectifs au DOR SNC80 et DeltII était maintenue chez les souris DOR-KO. Cette étude suggère donc que 1) DOR est nécessaire pour obtenir la pleine efficacité antinociceptive de la morphine et 2) que les agonistes du DOR ne sont pas sélectifs dans le test d'immersion de la queue en eau chaude. Les observations faites à l'objectif 1 soulèvent deux questions importantes : 1) DOR est-il nécessaire pour produire une interaction synergétique entre la morphine et un agoniste α2AR? 2) L'activation de DOR par des agonistes sélectifs à celui-ci est-elle suffisante pour obtenir une interaction synergétique avec un agoniste α2AR? Le deuxième objectif de cette thèse était donc de déterminer si l'activation de DOR est suffisante et nécessaire pour entraîner la synergie entre les opiacés et les α2AR au niveau spinal. L'absence d'effet antinociceptif de DeltII chez la souris DOR-KO a confirmé la sélectivité de cet agoniste avec le test comportemental à la substance P et a donc validé le choix de cet essai. Les interactions opiacés-adrénergiques ont été évaluées suivant la co-administration par voie spiale de la clonidine, un agoniste α2AR, avec la DeltII, la morphine ou le DAMGO chez les souris TS et DOR-KO. Nos résultats démontrent que la synergie entre DeltII+clonidine dépend du DOR, que la synergie entre morphine+clonidine n'est pas dépendante du DOR et que DAMGO+clonidine n'interagissent pas de façon synergétique. Ces découvertes confirment que l'activation du DOR est suffisante, mais pas nécessaire à la synergie avec les agonistes α2AR. Le troisième objectif de cette thèse était d'investiguer le rôle du récepteur α2AAR dans la synergie opiacée-adrénergique spinale et l'effet antinociceptif des opiacés. Nous avons premièrement confirmé que le α2AAR médie l'interaction synergétique entre la clonidine et la morphine ou la DeltII. Nous avons observé une potentiation de l'antinociception produite par la morphine ou la DeltII administrée par voie spinale chez la souris α2AAR-KO comparativement à la souris TS; cette potentiation n'a pas pu être attribuée à des changements du niveau d'expression des récepteurs opiacés, à l'altération des propriétés de liaison des ligands ou à l'augmentation du tonus adrénergique spinal. Ensemble, ces découvertes ont mené à la proposition d'un modèle dans lequel le α2AAR module de façon allostérique les récepteurs opiacés selon leur état d'activation. Ces études améliorent notre compréhension de l'interaction entre les médicaments α2 adrénergiques et les opiacés au niveau spinal, ce qui pourrait mener au développement de meilleurs traitements pharmacologiques pour la gestion de la douleur

Subtype-specific regulation of P2X3 and P2X2/3 receptors by phosphoinositides in peripheral nociceptors

Abstract Background P2X3 and P2X2/3 purinergic receptor-channels, expressed in primary sensory neurons that mediate nociception, have been implicated in neuropathic and inflammatory pain responses. The phospholipids phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) and phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate (PIP3) are involved in functional modulation of several types of ion channels. We report here evidence that these phospholipids are able to modulate the function of homomeric P2X3 and heteromeric P2X2/3 purinoceptors expressed in dorsal root ganglion (DRG) nociceptors and in heterologous expression systems. Results In dissociated rat DRG neurons, incubation with the PI3K/PI4K inhibitor wortmannin at 35 μM induced a dramatic decrease in the amplitude of ATP- or α,β-meATP-evoked P2X3 currents, while incubation with 100 nM wortmannin (selective PI3K inhibition) produced no significant effect. Intracellular application of PIP2 was able to fully reverse the inhibition of P2X3 currents induced by wortmannin. In Xenopus oocytes and in HEK293 cells expressing recombinant P2X3, 35 μM wortmannin incubation induced a significant decrease in the rate of receptor recovery. Native and recombinant P2X2/3 receptor-mediated currents were inhibited by incubation with wortmannin both at 35 μM and 100 nM. The decrease of P2X2/3 current amplitude induced by wortmannin could be partially reversed by application of PIP2 or PIP3, indicating a sensitivity to both phosphoinositides in DRG neurons and Xenopus oocytes. Using a lipid binding assay, we demonstrate that the C-terminus of the P2X2 subunit binds directly to PIP2, PIP3 and other phosphoinositides. In contrast, no direct binding was detected between the C-terminus of P2X3 subunit and phosphoinositides. Conclusion Our findings indicate a functional regulation of homomeric P2X3 and heteromeric P2X2/3 ATP receptors by phosphoinositides in the plasma membrane of DRG nociceptors, based on subtype-specific mechanisms of direct and indirect lipid sensing.</p

Effect of Human Genetic Variability on Gene Expression in Dorsal Root Ganglia and Association with Pain Phenotypes

Dorsal root ganglia (DRG) relay sensory information to the brain, giving rise to the perception of pain, disorders of which are prevalent and burdensome. Here, we mapped expression quantitative trait loci (eQTLs) in a collection of human DRGs. DRG eQTLs were enriched within untranslated regions of coding genes of low abundance, with some overlapping with other brain regions and blood cell cis-eQTLs. We confirm functionality of identified eQTLs through their significant enrichment within open chromatin and highly deleterious SNPs, particularly at the exon level, suggesting substantial contribution of eQTLs to alternative splicing regulation. We illustrate pain-related genetic association results explained by DRG eQTLs, with the strongest evidence for contribution of the human leukocyte antigen (HLA) locus, confirmed using a mouse inflammatory pain model. Finally, we show that DRG eQTLs are found among hits in numerous genome-wide association studies, suggesting that this dataset will help address pain components of non-pain disorders