Sensing of Oxygen Concentration in a Microfluidic Device mimicking Liver 3D Microarchitecture

International audienceWe designed a microfluidic structure which closely reproduces liver microarchitecture, constraining primary rat hepatocytes at a high density and in three dimensions (3D), and in which a gradient of oxygen can be generated. The device includes an oxygen sensitive membrane that could map the oxygen consumption of hepatocytes. INTRODUCTION Compared to classical two-dimensional cell culture, microfluidic devices or/and 3D culture conditions were evidenced to increase the period of time during which primary hepatocytes retain their functions [1]. Moreover, microfluidic techniques offer the opportunity to mimic the in vivo hepatocyte zonation, by subjecting hepatocytes to oxygen gradients [1-2]. Such oxygen gradients that can be estimated by numerical simulations, were recently experimentally assessed using an oxygen sensitive fluorescent membrane [3]. We proposed to include the oxygen sensitive membrane within a miniaturized fluidic device mimicking several hepatic cords in series, and inducing a gradient of oxygen on those. Moreover each of those hepatic cord units was inducing 3D organization of hepatocytes, due to the 72 µm height of culture chambers in which they can aggregate

Etude du rôle du facteur de transcription Pitx2 dans la régulation de l'hématopoïèse

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Approche de thérapie génique de l'hémophilie B par ciblage du FIX dans les granules alpha des plaquettes, dans un modèle de souris hémophile

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TRANSFERT DE GENES DANS LES CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUES HUMAINES (ETUDE DE L'INFLUENCE DE LA STRUCTURE RETROVIRALE SUR L'EXPRESSION DES TRANSGENES)

LE TRANSFERT DE GENES DANS LES CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUES (CSH) A DE NOMBREUSES APPLICATIONS, POUR LA THERAPIE GENIQUE COMME POUR LA COMPREHENSION DES MECANISMES DE REGULATION DE L'HEMATOPOIESE. EN RAISON DU FORT POUVOIR PROLIFERATIF DES CSH, UN TRANSFERT DE GENE STABLE A LONG TERME NECESSITE L'INTEGRATION DU TRANSGENE DANS LE GENOME DE LA CELLULE. EN OUTRE, DEUX PROBLEMES MAJEURS DOIVENT ETRE RESOLUS : LA TRANSDUCTION EFFICACE DES CSH, MAJORITAIREMENT QUIESCENTES, ET L'EXPRESSION A LONG TERME DES TRANSGENES. LES LENTIVIRUS AYANT LA PARTICULARITE D'INFECTER LES CELLULES INDEPENDAMMENT DU CYCLE CELLULAIRE, LES VECTEURS DERIVES DE CES VIRUS SONT MAINTENANT PREFERES A CEUX, DERIVES DES ONCORETROVIRUS, DONT LA TRANSDUCTION EST DEPENDANTE DU CYCLE CELLULAIRE. DANS CE TRAVAIL, NOUS AVONS MONTRE QU'UN VECTEUR LENTIVIRAL PERMETTAIT LE TRANSFERT DE GENES DANS LES CELLULES HEMATOPOIETIQUES D'AUTANT PLUS EFFICACEMENT QU'IL INCLUAIT LES SEQUENCES CONTROLANT LA FORMATION DE LA STRUCTURE ADN TRIPLEX CENTRAL. NOUS AVONS EGALEMENT MONTRE QUE LE VECTEUR TRIP AINSI OBTENU PERMETTAIT DE TRANSDUIRE AVEC LA MEME EFFICACITE TOUTE LA HIERARCHIE DES CELLULES HEMATOPOIETIQUES, INCLUANT LES CELLULES LES PLUS PRIMITIVES AYANT DES CAPACITES DE COLONISATION A LONG TERME DE LA MOELLE OSSEUSE DES SOURIS NOD-SCID. POUR AMELIORER L'EXPRESSION DU TRANSGENE ET LA SECURITE D'UTILISATION DU VECTEUR LENTIVIRAL, LE VECTEUR INITIAL A ETE MODIFIE EN DELETANT LES SEQUENCES PROMOTRICES ET ACTIVATRICES CONTENUES DANS LES LTR ET EN PLACANT LE TRANSGENE SOUS LA DEPENDANCE DU PROMOTEUR DU FACTEUR D'ELONGATION DE LA TRANSCRIPTION EF1-ALPHA, UN PROMOTEUR CELLULAIRE UBIQUITAIRE FORT. AVEC CE NOUVEAU VECTEUR, NOUS AVONS OBTENU UNE EXPRESSION FORTE, HOMOGENE, STABLE A LONG TERME DU TRANSGENE DANS TOUTES LES LIGNEES HEMATOPOIETIQUES ET DANS LES CELLULES PRIMITIVES. CE NOUVEAU VECTEUR OUVRE DE NOMBREUSES APPLICATIONS AUSSI BIEN POUR LA THERAPIE GENIQUE QUE POUR LA RECHERCHE FONDAMENTALE.PARIS7-Bibliothèque centrale (751132105) / SudocSudocFranceF

Approche originale de thérapie génique pour l'hémophilie B

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Cellules souches pluripotentes humaines et modélisation de maladies hépatiques

Le foie est associé à de nombreuses pathologies parmi lesquelles les maladies métaboliques et cholestatiques, les cirrhoses, les hépatites chroniques et aiguës. Toutefois, la connaissance des mécanismes impliqués dans la physiopathologie de ces maladies reste limitée du fait de la restriction des biopsies hépatiques et de l’absence de modèles cellulaires dérivés des patients qui en résulte. Le foie est aussi l’organe principal pour l’élimination des xénobiotiques et de ce fait les hépatocytes jouent un rôle clef en toxicologie et en pharmacocinétique. Les cellules souches pluripotentes induites générées à partir de patients atteints de maladies métaboliques monogéniques, pour lesquelles le gène correspondant est connu, représentent un modèle in vitro pertinent, d’une part pour l’étude des mécanismes impliqués dans la maladie ciblée, et d’autre part pour le criblage de médicaments pour sa correction. À cet effet, des protocoles efficaces pour générer des cellules hépatiques, les hépatocytes et les cholangiocytes, sont essentiels. Notre étude a porté sur la modélisation de l’hypercholestérolémie familiale, et sur l’établissement d’un protocole de différenciation des cellules souches pluripotentes en cholangiocytes fonctionnels

Cellules souches pluripotentes humaines et modélisation de maladies hépatiques (L'hypercholestérolémie familiale et les cholangiopathies)

La thérapie cellulaire pourrait représenter une alternative à la transplantation hépatique dans certaines pathologies comme les maladies métaboliques sévères. Toutefois, la pénurie de donneurs d organes implique la nécessité de trouver de nouvelles sources de cellules hépatiques comme les cellules souches pluripotentes qui peuvent être amplifiées extensivement et différenciées en tout type cellulaire. Les cellules souches embryonnaires humaines (hESC) et les cellules souches pluripotentes induites humaines (hiPSC) générées à partir des cellules somatiques de patients puis différenciées en hépatocytes représentent une source potentielle d hépatocytes. Ces cellules permettent en outre d envisager la transplantation d hépatocytes autologues génétiquement modifiés comme alternative à la transplantation hépatique pour le traitement de certaines maladies génétiques du foie. L hypercholestérolémie familiale (HF) est une maladie autosomale dominante due à des mutations dans le gène codant le Récepteur aux Low Density Lipoproteins (RLDL) qui est à l origine d un taux élevé de cholestérol sanguin de patients HF. Les patients homozygotes doivent épurer leur sérum par LDL-aphérèse en moyenne deux fois par mois dès le plus jeune âge pour éviter les infarctus mortels survenant dès l enfance. Les hépatocytes différenciées à partir des iPSC de patients et leur correction in vitro, permettent d'évaluer la faisabilité de la transplantation d'hépatocytes autologues génétiquement modifiés pour le traitement de l hypercholestérolémie familiale.Au cours du développement du foie, des hépatocytes et des cholangiocytes, les deux types de cellules épithéliales hépatiques, dérivent de progéniteurs hépatiques bipotents (les hépatoblastes). Bien que les cholangiocytes formant les canaux biliaires intrahépatiques ne représentent qu'une petite fraction de la population cellulaire totale du foie (3%), ces cellules régulent activement la composition de la bile par réabsorption des acides biliaires, un processus qui est important dans des maladies choléstatiques du foie. Dans la première partie de cette étude nous avons mis au point une approche de différenciation des cellules souches pluripotentes (hESC et hiPSC) en cholangiocytes fonctionnels. Ces cellules serviront à la modélisation des maladies génétiques touchant les cholangiocytes formant des canaux biliaires. Dans la deuxième partie, nous avons généré des iPSC spécifiques de patients HF (HF-iPSC), différenciées en hépatocytes et corrigé le défaut phénotypique par transfert lentiviral de l ADNc codant le LDLR dans les HF-iPSC.Cell therapy can be an alternative to liver transplantation in some cases such as severe metabolic diseases. However, the shortage of organ donors implies the need to find new sources of liver cells such as hepatocytes derived from pluripotent stem cells that can be amplified and differentiated extensively into any cell type. Human embryonic stem cells (hESC) and human induced pluripotent stem cells (hiPSC) generated from somatic cells of patients and then differentiated into hepatocytes represent a potential source of transplantable hepatocytes. These cells now make it possible to consider the transplantation of genetically modified autologous hepatocytes as an alternative to liver transplantation for the treatment of genetic diseases of the liver.Familial hypercholesterolemia (FH) is an autosomal dominant disorder caused by mutations in the gene encoding the receptor for Low Density Lipoproteins (LDLR), which is the cause of high blood cholesterol in these patients. Homozygous patients should purify their serum LDL-apheresis on average twice a month starting at a young age to avoid fatal myocardial infarction occurring in childhood.Human hepatocytes differentiated from patient s induced pluripotent stem cells (iPSCs) allow assessing the feasibility to transplant genetically modified autologous hepatocytes as treatment of familial hypercholesterolemia.During the liver development, hepatocytes and cholangiocytes, the two types of hepatic epithelial cells, derive from bipotent hepatic progenitors (hepatoblasts). Although cholangiocytes, forming intrahepatic bile ducts, represent a small fraction of the total liver cell population (3%), they actively regulate bile composition by secretion and reabsorption of bile acids, a process that is important in cholestatic liver diseases. In the first part of this study we developed an approach to differentiate pluripotent stem cells (hESC and hiPSC) into functional cholangiocytes. These cells could be used for the modeling of genetic biliary diseases. In the second part, we generated FH patient specific iPSCs (HF-iPSC), differentiated them into hepatocytes and tried to correct the disease phenotype by lentiviral introduction of LDLR cDNA cassette in HF-iPSC.PARIS11-SCD-Bib. électronique (914719901) / SudocSudocFranceF

Successful Derivation of Hepatoblasts, Cholangiocytes and Hepatocytes from Simian Induced Pluripotent Stem Cells

The use of primary cells in human liver therapy is limited by a lack of cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) represent an alternative to primary cells as they are infinitely expandable and can be differentiated into different liver cell types. The aim of our work was to demonstrate that simian iPSCs (siPSCs) could be used as a new source of liver cells to be used as a large animal model for preclinical studies. We first differentiated siPSCs into a homogenous population of hepatoblasts (siHBs). We then separately differentiated them into hepatocytes (siHeps) and cholangiocytes (siChols) expressing respective specific markers and displaying epithelial polarity. Moreover, we showed that polarized siChols can self-organize into 3D structures. These results should facilitate the deciphering of liver development and open the way to exploring co-culture systems that could be assessed during preclinical studies, including in autologous monkey donors, for regenerative medicine purposes

Improving Hepatocyte Engraftment Following Hepatocyte Transplantation Using Repeated Reversible Portal Vein Embolization in Rats

International audienceHepatocyte transplantation (HT) has emerged as a promising alternative to orthotopic liver transplantation, yet liver preconditioning is needed to promote hepatocyte engraftment. A method of temporary occlusion of the portal flow called reversible portal vein embolization (RPVE) has been demonstrated to be an efficient method of liver preconditioning. By providing an additional regenerative stimulus, repeated reversible portal vein embolization (RRPVE) could further boost liver engraftment. The aim of this study was to determine the efficiency of liver engraftment of transplanted hepatocytes after RPVE and RRPVE in a rat model. Green fluorescent protein-expressing hepatocytes were isolated from transgenic rats and transplanted into 3 groups of syngeneic recipient rats. HT was associated with RPVE in group 1, with RRPVE in group 2, and with sham embolization in the sham group. Liver engraftment was assessed at day 28 after HT on liver samples after immunostaining. Procedures were well tolerated in all groups. RRPVE resulted in increased engraftment rate in total liver parenchyma compared with RPVE (3.4% ± 0.81% versus 1.4% ± 0.34%; P < 0.001). In conclusion, RRPVE successfully enhanced hepatocyte engraftment after HT and could be helpful in the frame of failure of HT due to low cell engraftment