Modulation de la structure de la chromatine par la poly(ADP-ribosyl)ation

Nous avons caractérisé les protéines chromosomales acceptrices depoly(ADP-ribose) dans différents niveaux d'organisation de la chromatine et nous avons étudié l'effet structural de leur poly(ADP-ribosyl)ation sur la structure chromatinienne. Premièrement, nous avons démontré à l'aide de techniques d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide que le patron des histones poly(ADP-ribosyl)ées dans des préparations de chromatine native varie selon l'état d'automodification de la poly(ADP-ribose) polymérase. Les histones H1, H1°, H2B, H2A et A24 sont principalement modifiées dans des conditions où l'enzyme est faiblement modifiée ( ≤1 uM NAD+). Lorsque l'enzyme est fortement modifiée ( ≥ 10 uM NAD+), l'histone H1 est préférentiellement hyper(ADP-ribosyl)ée. Par la suite, nous avons démontré à l'aide de techniques de microscopie électronique et d'ultracentrifugation analytique qu'à des concentrations physiologiques de NAD+ (200 uM), la synthèse et l'hydrolyse du poly(ADP-ribose) par l'action séquentielle de la poly(ADP-ribose) polymérase et de la poly(ADP-ribose) glycohydrolase purifiées sur la chromatine native provoquent une décondensation-recondensation réversible de la fibre chromatinienne de 30 nm. Ce phénomène est attribué à la formation et à la dégradation des formes hyper(ADP-ribosyl)ées de l'histone H1. Deuxièmement, nous avons montré que le patron des histones modifiées varie également selon les différents niveaux d'organisation de la chromatine à des concentrations physiologiques de NAD+. L'histone H1 est l'histone acceptrice majeure dans la chromatine native tandis que les histones H2B, H2A et A24 sont principalement modifiées dans la chromatine dépourvue en histone H1 et dans des préparations de coeurs nucléosomaux purifiés. Nous avons par la suite observé par microscopie électronique que la poly(ADP-ribosyl)ation de coeurs nucléosomaux purifiés dans ces conditions provoque la dissociation de l'ADN qui entoure l'octamère d'histones. Nous avons également démontré que la poly(ADP-ribosyl)ation de la chromatine dépourvue en histone H1 empêche la génération de la fibre de 30 nm lors de l'addition de l'histone H1. Ce phénomène semble être attribué à la présence des histones modifiées dans l'octamère et/ou de la poly(ADP-ribose) polymérase modifiée puisqu'une forte interaction de celle-ci a été observée sur la chromatine dépourvue en histone H1 tandis qu'une interaction négligeable a été observée avec la chromatine native. Nous avons également observé une interaction importante du poly(ADP-ribose) avec des coeurs nucléosomaux purifiés. Troisièmement, par une approche immunologique, nous avons observé une plus grande accessibilité des histones de l'octamère à différents anticorps monoclonaux et polyclonaux anti histones dans la chromatine native et la chromatine dépourvue en histone H1 poly(ADP-ribosyl)ées. L'ensemble de ces résultats suggère une déstabilisation importante de la structure chromatinienne par la poly(ADP-ribosyl)ation. Nous proposons ainsi un modèle dans lequel la poly(ADP-ribosyl)ation serait impliquée dans la modulation de la structure chromatinienne lors de réparation d'ADN

Modulation de la structure de la chromatine par la poly(ADP-ribosyl)ation

Nous avons caractérisé les protéines chromosomales acceptrices depoly(ADP-ribose) dans différents niveaux d'organisation de la chromatine et nous avons étudié l'effet structural de leur poly(ADP-ribosyl)ation sur la structure chromatinienne. Premièrement, nous avons démontré à l'aide de techniques d'électrophorèse sur gel de polyacrylamide que le patron des histones poly(ADP-ribosyl)ées dans des préparations de chromatine native varie selon l'état d'automodification de la poly(ADP-ribose) polymérase. Les histones H1, H1°, H2B, H2A et A24 sont principalement modifiées dans des conditions où l'enzyme est faiblement modifiée ( ?1 uM NAD+). Lorsque l'enzyme est fortement modifiée ( ? 10 uM NAD+), l'histone H1 est préférentiellement hyper(ADP-ribosyl)ée. Par la suite, nous avons démontré à l'aide de techniques de microscopie électronique et d'ultracentrifugation analytique qu'à des concentrations physiologiques de NAD+ (200 uM), la synthèse et l'hydrolyse du poly(ADP-ribose) par l'action séquentielle de la poly(ADP-ribose) polymérase et de la poly(ADP-ribose) glycohydrolase purifiées sur la chromatine native provoquent une décondensation-recondensation réversible de la fibre chromatinienne de 30 nm. Ce phénomène est attribué à la formation et à la dégradation des formes hyper(ADP-ribosyl)ées de l'histone H1. Deuxièmement, nous avons montré que le patron des histones modifiées varie également selon les différents niveaux d'organisation de la chromatine à des concentrations physiologiques de NAD+. L'histone H1 est l'histone acceptrice majeure dans la chromatine native tandis que les histones H2B, H2A et A24 sont principalement modifiées dans la chromatine dépourvue en histone H1 et dans des préparations de coeurs nucléosomaux purifiés. Nous avons par la suite observé par microscopie électronique que la poly(ADP-ribosyl)ation de coeurs nucléosomaux purifiés dans ces conditions provoque la dissociation de l'ADN qui entoure l'octamère d'histones. Nous avons également démontré que la poly(ADP-ribosyl)ation de la chromatine dépourvue en histone H1 empêche la génération de la fibre de 30 nm lors de l'addition de l'histone H1. Ce phénomène semble être attribué à la présence des histones modifiées dans l'octamère et/ou de la poly(ADP-ribose) polymérase modifiée puisqu'une forte interaction de celle-ci a été observée sur la chromatine dépourvue en histone H1 tandis qu'une interaction négligeable a été observée avec la chromatine native. Nous avons également observé une interaction importante du poly(ADP-ribose) avec des coeurs nucléosomaux purifiés. Troisièmement, par une approche immunologique, nous avons observé une plus grande accessibilité des histones de l'octamère à différents anticorps monoclonaux et polyclonaux anti histones dans la chromatine native et la chromatine dépourvue en histone H1 poly(ADP-ribosyl)ées. L'ensemble de ces résultats suggère une déstabilisation importante de la structure chromatinienne par la poly(ADP-ribosyl)ation. Nous proposons ainsi un modèle dans lequel la poly(ADP-ribosyl)ation serait impliquée dans la modulation de la structure chromatinienne lors de réparation d'ADN

ampG Gene of Pseudomonas aeruginosa and Its Role in β-Lactamase Expression ▿

In enterobacteria, the ampG gene encodes a transmembrane protein (permease) that transports 1,6-GlcNAc-anhydro-MurNAc and the 1,6-GlcNAc-anhydro-MurNAc peptide from the periplasm to the cytoplasm, which serve as signal molecules for the induction of ampC β-lactamase. The role of AmpG as a transporter is also essential for cell wall recycling. Pseudomonas aeruginosa carries two AmpG homologues, AmpG (PA4393) and AmpGh1 (PA4218), with 45 and 41% amino acid sequence identity, respectively, to Escherichia coli AmpG, while the two homologues share only 19% amino acid identity. In P. aeruginosa strains PAO1 and PAK, inactivation of ampG drastically repressed the intrinsic β-lactam resistance while ampGh1 deletion had little effect on the resistance. Further, deletion of ampG in an ampD-null mutant abolished the high-level β-lactam resistance that is associated with the loss of AmpD activity. The cloned ampG gene is able to complement both the P. aeruginosa and the E. coli ampG mutants, while that of ampGh1 failed to do so, suggesting that PA4393 encodes the only functional AmpG protein in P. aeruginosa. We also demonstrate that the function of AmpG in laboratory strains of P. aeruginosa can effectively be inhibited by carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP), causing an increased sensitivity to β-lactams among laboratory as well as clinical isolates of P. aeruginosa. Our results suggest that inhibition of the AmpG activity is a potential strategy for enhancing the efficacy of β-lactams against P. aeruginosa, which carries inducible chromosomal ampC, especially in AmpC-hyperproducing clinical isolates

Real-Time PCR Assay for Detection of Fluoroquinolone Resistance Associated with grlA Mutations in Staphylococcus aureus

Resistance to fluoroquinolones among clinical isolates of Staphylococcus aureus has become a clinical problem. Therefore, a rapid method to identify S. aureus and its susceptibility to fluoroquinolones could provide clinicians with a useful tool for the appropriate use of these antimicrobial agents in the health care settings. In this study, we developed a rapid real-time PCR assay for the detection of S. aureus and mutations at codons Ser-80 and Glu-84 of the grlA gene encoding the DNA topoisomerase IV, which are associated with decreased susceptibility to fluoroquinolones. The detection limit of the assay was 10 genome copies per reaction. The PCR assay was negative with DNA from all 26 non-S. aureus bacterial species tested. A total of 85 S. aureus isolates with various levels of fluoroquinolone resistance was tested with the PCR assay. The PCR assay correctly identified 100% of the S. aureus isolates tested compared to conventional culture methods. The correlation between the MICs of ciprofloxacin, levofloxacin, and gatifloxacin and the PCR results was 98.8%. The total time required for the identification of S. aureus and determination of its susceptibility to fluoroquinolones was about 45 min, including DNA extraction. This new rapid PCR assay represents a powerful method for the detection of S. aureus and its susceptibility to fluoroquinolones

A low-cost, disposable card for rapid polymerase chain reaction

A low-cost, disposable card for rapid polymerase chain reaction (PCR) was developed in this work. Commercially available, adhesive-coated aluminum foils and polypropylene films were laminated with structured polycarbonate films to form microreactors in a card format. Ice valves [1] were employed to seal the reaction chambers during thermal cycling and a Peltier-based thermal cycler was configured for rapid thermal cycling and ice valve actuation. Numerical modeling was conducted to optimize the design of the PCR reactor and investigate the thermal gradient in the reaction chamber in the direction of sample thickness. The PCR reactor was experimentally characterized by using thin foil thermocouples and validated by a successful amplification of 10 copy of E. coli tuf gene in 27 min.close151