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The Embryonic Stem Cell Test as Tool to Assess Structure-Dependent Teratogenicity: The Case of Valproic Acid
Teratogenicity can be predicted in vitro using the embryonic stem cell test (EST). The EST, which is based on the morphometric measurement of cardiomyocyte differentiation and cytotoxicity parameters, represents a scientifically validated method for the detection and classification of chemicals according to their teratogenic potency. Furthermore, an abbreviated protocol applying flow cytometry of intracellular marker proteins to determine differentiation into the cardiomyocyte lineage is available. Although valproic acid (VPA) is in worldwide clinical use as antiepileptic drug, it exhibits two severe side effects, i.e., teratogenicity and hepatotoxicity. These limitations have led to extensive research into derivatives of VPA. Here we chose VPA as model compound to test the applicability domain and to further evaluate the reliability of the EST. To this end, we study six closely related congeners of VPA and demonstrate that both the standard and the molecular flow cytometry-based EST are well suited to indicate differences in the teratogenic potency among VPA analogs that differ only in chirality or side chain length. Our data show that identical results can be obtained by using the standard EST or a shortened protocol based on flow cytometry of intracellular marker proteins. Both in vitro protocols enable to reliably determine differentiation of murine stem cells toward the cardiomyocyte lineage and to assess its chemical-mediated inhibition
Analysis of the differentiation of myocardial and neural cells for the enhancement of the Embryonic Stem Cell Test (EST)
Die Arbeit hatte zum Ziel, den Embryonalen Stammzelltest (EST) durch die
Etablierung von molekularen Endpunkten weiter zu entwickeln. In Vorversuchen
wurden molekulare Endpunkte fĂŒr die Erfassung der
Herzmuskelzelldifferenzierung geprĂŒft. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag in
der Etablierung eines Protokolls basierend auf einem neuen Endpunkt zur
Erfassung von Substanzeffekten auf die neuronale Differenzierung sowie in der
Charakterisierung der sich differenzierenden neuralen Zellen. ZunÀchst konnte
gezeigt werden, dass die Differenzierung zu Herzmuskelzellen anhand der Marker
fĂŒr die skelettalen Muskelzellproteine MHC (myosin heavy chain) und α-Actinin
immunfluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen und im Durchflusszytometer
quantitativ erfasst werden kann. Anhand einer Zeitanalyse ĂŒber 20 Tage wurde
festgestellt, dass der optimale Zeitpunkt fĂŒr die Messung der beiden
intrazellulÀren Proteinmarker der Tag 7 der Differenzierung ist. Die neuen
molekularen Endpunkte wurden anhand von drei in der Validierungsstudie
klassifizierten Substanzen 5-Fluorouracil, all-trans RetinsÀure und Penicillin
G mit dem validierten Endpunkt, der mikroskopischen Erfassung der
Herzmuskelzell-kontraktionen, verglichen. Bei der Ermittlung der ID50-Werte
fĂŒr die 50%ige Hemmung der Differenzierung wurden gut ĂŒbereinstimmende
Ergebnisse erzielt. FĂŒr die Optimierung eines Protokolls zur neuralen
Differenzierung wurden insbesondere die Einflussfaktoren Zellzahl,
Mediumzusammensetzung und Beschichtungsform untersucht. ZunÀchst wurden die D3
Zellen auf Gelatine-beschichteten Zellkulturplatten differenziert, auf Basis
dessen die meisten Substanztestungen durchgefĂŒhrt wurden. Ăber die Zeit
fĂŒhrten weitere Optimierungsschritte zu einem Protokoll, bei dem die Zellen
auf Poly-L-Ornithin- (PLO)-beschichteten Platten unter Zugabe von Laminin
differenziert wurden. Damit konnte nachweislich der Anteil an differenzierten
Neuronen in der Kultur erhöht werden. Anhand beider Protokollvarianten wurde
gezeigt, dass die mES Zellen wÀhrend der voranschreitenden Differenzierung
eine zeitlich gestaffelte Entwicklung durchlaufen, beginnend mit der
Proliferation neuraler VorlÀuferzellen bis hin zur Bildung reifer Neuronen und
Gliazellen. Dies wurde anhand von zelltypischen Markern fĂŒr VorlĂ€uferzellen,
Neuronen und Gliazellen immunfluoreszenz-mikroskopisch dokumentiert. Mit Hilfe
von durchflusszytometrischen Analysen gelang es neuronale und gliale Proteine
anhand der Marker Mikrotubulin-assoziiertes Protein 2 (MAP2), Ă-Tubulin III,
α-Internexin, saures gliale Faserprotein (GFAP) und 2',3'-zyklisches Nukleotid
3'-Phophodiesterase (CNPase) ĂŒber die Zeit von 30 Tagen zu quantifizieren. Der
Nachweis von synaptischen Vesikeln und Neurotransmittern lieferte zudem
Hinweise auf die Entwicklung funktional ausgereifter Neuronen und Gliazellen.
Des Weiteren reagierten die differenzierten Zellen auf die Stimulierung mit
Neurotransmitter bzw. deren Agonisten spezifisch mit einem Anstieg an
intrazellulÀrem Ca2+, was auf die Ausbildung von Glutamat- und Dopamin-
spezifischen Rezeptoren schlieĂen lĂ€sst. Die quantitativen Untersuchungen
zeigten, dass die Neuronen anhand des Markers MAP2 am Tag 12 der
Differenzierung standardisiert erfasst werden können. Anhand von Substanztests
mit 5-Fluorouracil, Penicillin G, Lithiumchlorid, ValproinsÀure und
Methylazoxymethanolacetat wurde demonstriert, dass durch die Bestimmung dieses
Endpunktes in den meisten FĂ€llen reproduzierbare Konzentrations-Wirkungskurven
erzeugt werden können. Im Vergleich zu den Daten, die bei der Erfassung der
ZellviabilitÀt im MTT-Test erhoben wurden, zeigte es sich, dass der ID50-Wert
fĂŒr die Differenzierung mit dem IC50-Wert, dem Wert fĂŒr die 50%ige Hemmung der
ViabilitÀt der sich differenzierenden Zellen, in den meisten FÀllen
zusammenfÀllt. Bei Lithiumchlorid war aufgrund der abweichend niedrigeren
ID50-Werte ein spezifischer Effekt auf die Differenzierung von MAP2-positiven
Neuronen zu erkennen. Anhand der Untersuchung von ValproinsÀure konnte
zusÀtzlich gezeigt werden, dass sowohl bei der Differenzierung der Zellen nach
dem Gelatine- als auch nach dem PLO-Protokoll, gleiche ID50- und IC50-Werte
erzielt wurden.The aim of this work was to improve the Embryonic Stem Cell Test (EST) further
by establishing predictive molecular endpoints. Preliminary investigations
were made to establish molecular markers in order to substitute the visual
determination of the cardiac differentiation. The focus of this work was to
develop a new molecular endpoint for measuring developmental neurotoxicity.
For this purpose it was necessary to optimize a protocol for neural
differentiation which is adequate for substance testing and also to
characterize the differentiated neural cells. Applying immunofluorescence
microscopy for qualitative and flow cytometry for quantitative analysis it has
been shown that the skeletal proteins myosin heavy chain (MHC) and α-actinin
are sensitive markers for the detection of myocardial differentiation. A 20
day quantitative analysis of the differentiation demonstrated, that both
intracellular protein markers could be best monitored on day 7 of cultivation.
With three substances previously tested in the EST validation study -
5-fluorouracil, all-trans retinoic and penicillin G - it was shown that
comparable ID50 (concentration of half maximal inhibition of differentiation)
values can be obtained using the molecular endpoints. In order to optimize a
protocol for neural differentiation suitable for chemical testing, the main
focus was determining the effect of the parameters cell count, medium
composition and surface coating. First the cells were differentiated on
gelatin-coated cell culture dishes, which most of the substance tests are
based on. Further investigations led to the development of a poly-l-ornithin
(PLO) based protocol supplemented with laminin, which enhanced the proportion
of neurons in the differentiated culture. With both protocols it was shown,
that the differentiation is a time-dependent, graduated developmental process
which started with the proliferation of neural precursor cells and ended with
the generation of mature neurons and glial cells. This was monitored, using
immunofluorescence microscopy, by typical specific protein markers of
precursor cells, neurons and glial cells. Using the markers microtubule-
associated protein 2 (MAP2), Ă-tubulin III, α-Internexin, glial fibrillary
acidic protein (GFAP) and 2', 3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase
(CNPase), neurons and glial cells were also quantified by flow cytometry
analysis until day 30 of differentiation. The presence of presynaptic vesicles
and neurotransmitters indicated functional maturation of the differentiated
cells. It was also shown, that the differentiated cells responded to different
agonists of glutamate and dopamine receptors with temporary increases of
intracellular Ca2+-levels. Quantitative investigations demonstrated that
neurons were best detected with the protein marker MAP2 on day 12 of the
differentiation. To evaluate the applicability of the endpoint, the substances
5-fluorouracil, penicillin G, lithium chloride, valproic acid and
methylazoxymethanolacetate were examined applying flow cytometry analysis.
Most of the tests showed reproducible concentration-response curves. When
compared to the effect on cell viability recorded in the MTT-cytotoxicity
assay it was shown, that the ID50 value for differentiation is mostly similar
to the IC50 value for the half maximal inhibition of viability of all
differentiating cells in culture. With lithium chloride, a specific effect was
detected on the differentiating MAP2-positive neurons. Using valproic acid it
was shown that both differentiation protocols (gelatin and PLO-protocol)
generated identical ID50 and IC50 values