Efecto antitumoral de inmunotoxinas anti-tn conjugadas con granulisina

Este grupo de investigación ha venido estudiando por más de dos décadas la granusilina recombinante de 9 KDa (GRNLY), a partir de una colaboración con el laboratorio del Dr. Krensky, descubridor de la molécula. Se demostró la capacidad antitumoral de la GRNLY recombinante en estudios in vitro y en modelos de desarrollo de tumores humanos xenotransplantados en ratones atímicos, mediante administración intratumoral. Posteriormente, se desarrolló una estrategia para direccionar la molécula con miras a el uso sistémico. Como prueba de concepto, se generó en colaboración con la Dra. Laura Sanz una inmunotoxina dirigida contra el antígeno carcino embrionario (CEA) y se demostró su capacidad de direccionar el tratamiento hacia el tumor en un modelo atímico xenotransplantado con células tumorales que expresaban CEA. La GRNLY en solitario no era capaz de detener el crecimiento tumoral por inyeccón sistémica. Más adelante, en colaboración con el Dr. Ramón Hurtado, experto en el estudio de las glicosilaciones proteicas, se desarrollaron dos inmunotoxinas dirigidas contra el antígeno asociado a tumor Tn, encaminadas a su uso sistémico en un número mayor de tumores que la inmunotoxina anti-CEA. El modelo de expresión que usamos fue P .pastoris, que genera proteínas plegadas y glicosiladas que no contienen lipopolisacáricos (LPS), problemas éstos asociados con las proteínas recombinantes producidas en E.coli. Fue necesaria la optimización del protocolo y en ese proceso, el Dr. Javier Raso nos asesoró para mejorar los procesos biotecnológicos asociados y se innovó mediante la técnica de electroporación por campos eléctricos pulsados o PEF. El exitoso proceso incrementó el rendimiento y además se introdujeron protocolos adecuados de estabilización de las inmunotoxinas para su conservación a largo plazo. Inicialmente, se demostró que la fracción scFv de la inmunotoxina mantiene su afinididad por su antígeno purificado o expresado en la superficie de células tumorales. En general, las inmunotoxinas resultaron más citotóxicas sobre las líneas celulares a las que se unía con mayor afinidad la inmunotoxina, debido a una mayor expresión del antígeno Tn. Estudios previos mostraron que la GRNLY actúa mediante activación de la vía intrínseca de la apoptosis y en menor proporción, activación de la vía de la necroptosis y la esfingomielininasa. Se demostró que las inmunotoxinas, aunque también ejercen muerte celular al menos parcialmente a través de mecanismos apoptóticos y necroptóticos, son capaces de activar además un mecanismos necróticos que actúa con mayor rapidez. Gracias a las mejoras al rendimiento de producción de las proteínas, se pudieron realizar los ensayos in vivo en un modelo NUDE xenotransplantado con el adenocarcinoma de páncreas humano CAPAN-2. En este modelo se demostró que las inmunotoxinas SM3GRNLY y AR20.5GRNLY fueron eficientes tras inyección sistémica, disminuyendo el volumen tumoral en un 40 y un 60% respectivamente. En consonancia con el mecanismo apoptótico señalado, los cortes histológicos de tumores derivados de los ratones atímicos mostraron morfología nuclear compatible con apoptosis y marcaje positivo en inmunohistoquímica de Caspasa-3 activada.Un aspecto a considerar acerca de los resultados obtenidos en los modelos atímicos heterólogos es la falta de certeza respecto a la respuesta inmunogénica, debido a que las células inmunitarias, citocinas y matriz extracelular derivan de ratón mientras que el tumor y la granulisina son humanos. En este contexto, como primer acercamiento, se ensayó la GRNLY intratumoral en un modelo murino humanizado, los ratones NOD Rag gamma (NRG) xenotransplantados con la línea de adenocarcinoma de colon humano HT-29. Estos experimentos demostraron que se puede utilizar este modelo para futuros estudios sobre el auténtico potencial inmunogénico de la granulisina y sus inmunotoxinsas. La optimización de los protocolos biotecnológicos y la introducción de la técnica PEF para la producción/purificación de las proteínas recombinantes en el sistema de expresión P. pastoris permite continuar con la investigación de los mecanismos de acción de las inmunotoxinas y trasladar la experimentación a un modelo murino humanizado para corroborar su inmunogenicidad. La patente de las proteínas recombinantes usadas en este estudio fue adquirida por la empresa Peaches Biotech, de modo que esta investigación ha despertado el interés de las empresas farmacéuticas con perspectivas para su uso en humanos. <br /

Role of PknH in Mycobacterium tuberculosis Complex virulence. Involvement of lung myeloid cells in vaccine-induced protection of pulmonary delivered BCG

La tuberculosis es actualmente la enfermedad infecciosa asociada a un único patógeno más devastadora, causando alrededor de 1.5 millones de muertes en 2018. A pesar de la existencia de la vacuna BCG y su amplia administración, su protección variable contra las formas respiratorias de la enfermedad junto con la creciente aparición de cepas resistentes a los antibióticos, convierte a la tuberculosis en un alarmante problema de salud global. La tuberculosis es causada en mamíferos por organismos del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MTBC), cuyos genomas presentan más del 99% de homología. Sin embargo, los miembros del MTBC muestran importantes diferencias en cuanto a especificidad de huésped y virulencia. Mycobacterium tuberculosis es el principal agente causal de la tuberculosis en humanos, mientras que otros miembros del MTBC causan tuberculosis en un amplio rango de mamíferos, como Mycobacterium bovis, el principal agente causal de la tuberculosis bovina. La tuberculosis bovina provoca importantes pérdidas económicas a nivel global asociadas al control de la enfermedad y a pérdidas de producción, tanto en países desarrollados como en países en vías de desarrollo. Además, la infección zoonótica causada por M. bovis representa una amenaza para la salud humana. A pesar de su alto grado de homología genómica, M. tuberculosis y M. bovis presentan importantes diferencias fenotípicas. M. bovis ha demostrado ser más virulenta que M. tuberculosis en diferentes modelos animales, y aunque M. tuberculosis no produce enfermedad en el ganado, M. bovis presenta un amplio rango de hospedadores, que incluye diferentes animales mamíferos salvajes y domesticados, así como el ser humano. En este trabajo, hemos caracterizado la infección de diferentes miembros del MTBC en modelo de ratón con el objetivo de definir sus diferencias de virulencia in vivo. Se ha observado que M. bovis presenta mayor virulencia que M. tuberculosis y M. africanum, al inducir mayor patología pulmonar y presentar mayor capacidad de diseminación, así como mayor grado de infectividad en pulmón y mayor infiltración de neutrófilos pulmonares. Sin embargo, a pesar de las diferencias de infección observadas entre M. bovis y M. tuberculosis, los mecanismos genéticos y moleculares responsables de las diferencias en virulencia y especificidad de huésped no son conocidos. La PknH es una serina/treonina quinasa implicada en la regulación de diversos procesos bacterianos en M. tuberculosis que, además, ha sido relacionada con virulencia. La organización genética de la región del genoma que contiene el gen de la pknH (región RD900) presenta gran variación a lo largo de los miembros del MTBC, entre los que se encuentran M. tuberculosis y M. bovis. Con el objetivo de estudiar las consecuencias de estas variaciones, hemos analizado la organización genética de la región RD900 y de los genes pknH en el contexto evolutivo del MTBC, demostrando la existencia de deleciones independientes de la región RD900 en diferentes linajes del MTBC y en diferentes cepas del mismo linaje. Además, se ha observado una deleción en una región correspondiente a un dominio rico en prolinas en el gen de la pknH conservada en M. bovis y M. caprae respecto al resto de especies del MTBC. El posible papel diferencial de la PknH en la regulación de la virulencia de M. bovis como consecuencia de estas variaciones ha sido evaluado mediante la construcción y caracterización de cepas mutantes de la PknH de M. bovis y M. tuberculosis. La inserción de la PknH de M. tuberculosis en el genoma de cepas de M. bovis dio lugar a una reducción de la virulencia de las cepas mutantes respecto a las cepas silvestres de M. bovis. Además, los perfiles de expresión génica de estas cepas mostraron diferencias en la expresión de un amplio conjunto de genes, lo que sugiere un posible papel diferencial de la PknH en la regulación de la virulencia de M. tuberculosis y M. bovis. La falta de eficacia de BCG en la protección contra la tuberculosis pulmonar convierte el desarrollo de nuevas estrategias de vacunación efectivas en una necesidad urgente. El uso de rutas alternativas de vacunación para la administración de BCG o de nuevos candidatos a vacuna ha cobrado un renovado interés durante los últimos años. Una de las rutas alternativas de administración más estudiadas es la ruta pulmonar, cuyo objetivo es mimetizar la vía natural de infección de M. tuberculosis. Diversos estudios preclínicos en diferentes modelos animales han demostrado que la vacunación pulmonar con BCG confiere mejor protección que la vacunación por vía subcutánea o intradérmica. Sin embargo, los estudios de la respuesta inmune inducida por la vacunación pulmonar con BCG realizados hasta el momento están centrados en el estudio de respuestas adaptativas, pero existen pocos datos de la inmunidad innata local y de la interacción de BCG con las células mieloides del pulmón. En este trabajo, hemos administrado micobacterias virulentas y atenuadas que expresan GFP por vía pulmonar, con el objetivo de caracterizar in vivo las poblaciones de células mieloides infectadas en el pulmón y las diferencias en la dinámica de infección en modelo de ratón, observándose grandes diferencias en los patrones de diseminación de M. tuberculosis y BCG. Mientras que BCG permanece principalmente en los macrófagos, M. tuberculosis disemina de forma activa de macrófagos a neutrófilos en un mecanismo dependiente de RD1. La presencia de BCG en los pulmones da lugar a la activación de los macrófagos del pulmón. Como consecuencia, la replicación y diseminación a neutrófilos de M. tuberculosis queda restringida cuando el patógeno es fagocitado por macrófagos pre-activados en ratones previamente vacunados con BCG por vía pulmonar, pero no subcutánea, lo que correlaciona con un elevado nivel de protección. Además, se ha demostrado que el mecanismo de activación de los macrófagos pulmonares inducido por BCG requiere la contribución de las células T CD4 para su generación, pero no para su mantenimiento. De forma relevante, la vacunación pulmonar con BCG induce la activación a largo plazo de los macrófagos alveolares, los cuales mantienen su estatus de activación y capacidad bactericida durante largo tiempo una vez que la vacuna ha sido eliminada del pulmón, lo que sugiere la generación de rasgos de memoria en los macrófagos pulmonares. Estos resultados destacan la gran importancia de la dinámica celular de infección para el éxito de la infección temprana con M. tuberculosis y sugieren que los macrófagos del pulmón contribuyen de manera crucial a la protección temprana contra la tuberculosis inducida por vacunas vivas administradas por vía pulmonar.Tuberculosis (TB) is nowadays the most devastating infectious disease associated with a single pathogen. Despite the existence of the widely administered BCG vaccine, its variable protection against pulmonary TB along with the rising appearance of drug resistant strains makes this disease an alarming global health problem, causing an estimated 1.5 million deaths in 2018. TB is caused in humans and animals by organisms from the Mycobacterium tuberculosis Complex (MTBC), that show more than 99% genetic identity but exhibit distinct host preference and virulence. Unlike the human restriction of M. tuberculosis, Mycobacterium bovis, the causative agent of bovine TB, has one of the broadest host ranges of all known pathogens and exacts a global tremendous economic burden in both developed and developing countries. Although it mainly infects cattle, M. bovis exhibits transmissibility across many other mammalian species and it has been found to be more virulent than M. tuberculosis in different animal models. However, the molecular genetic changes that underly host specificity and infection phenotype within MTBC members have not been fully elucidated. In this work, we performed a comparison study between M. tuberculosis, M. bovis and M. africanum strains regarding their virulence and dissemination ability in vivo. In addition, we analysed RD900 genomic region across MTBC members using whole genome sequences from different MTBC strains so as to determine its role in the context of MTBC evolutionary history. The RD900 region comprises two homologous genes encoding the serine/threonine protein kinase PknH flanking the tbd2 gene. PknH is involved in the regulation of several bacterial processes and has been associated with virulence in M. tuberculosis. This analysis revealed that RD900 has been independently lost in different MTBC lineages and different strains, resulting in the generation of a single pknH gene. Importantly, all the analysed M. bovis and M. caprae strains carry a conserved deletion within a proline rich-region of pknH genes independent of RD900 presence or absence. We hypothesized that conservation of this deletion in M. bovis may affect PknH function, having a potential role in its virulence and evolutionary adaptation. To explore this hypothesis, we constructed and characterized M. bovis and M. tuberculosis pknH mutant strains. M. bovis knock-in strains containing the M. tuberculosis complete pknH gene revealed a reduced virulence compared to the wild type in the mouse model, suggesting that PknH plays an important role in the differential virulence phenotype of M. bovis vs M. tuberculosis. The failure of BCG to protect against pulmonary TB results in an urgent need for the development of new effective TB vaccines strategies. The use of alternative routes of administration for the delivery of BCG or new vaccine candidates has emerged a renewed interest during the last years. One of the most studied non-canonical routes of administration is the pulmonary delivery, with the rationale of mimicking the natural route of M. tuberculosis infection. In this regard, preclinical studies in different animal models have shown that pulmonary BCG confers significantly improved protection compared to subcutaneous or intradermal vaccination. However, current immunogenicity studies about mucosal immune responses elicited by pulmonary BCG are focused on adaptive responses, with few data of local innate immunity and BCG interaction with lung myeloid cells. In the present study, we pulmonary delivered GFP-expressing virulent and attenuated mycobacteria to characterize infected lung myeloid populations and differences in cellular infection dynamics occurring in vivo in the mouse model. We found profound differences in dissemination patterns between M. tuberculosis and BCG. Whereas BCG mainly remained in the macrophage compartment, M. tuberculosis actively spread from macrophages to neutrophils in a mechanism dependent on RD1-containg genes. BCG presence in lungs leads to the activation of lung macrophages. As a consequence, M. tuberculosis replication and neutrophil dissemination is impaired when M. tuberculosis is engulfed by BCG pre-activated macrophages in pulmonary, but not subcutaneous, vaccinated mice, which correlates with a strong vaccine-induced protection. Furthermore, we show that lung macrophages are activated by pulmonary BCG in a mechanism that required the contribution of CD4 T cells for the induction, but not maintenance, of their activation status. Noteworthy, pulmonary BCG induced long-term activation of alveolar macrophages, which maintain their activation status and early bactericidal capacity long after vaccine clearance, suggesting the generation of a memory-like response in lung macrophages. These results highlight a crucial importance of bacterial cell-to-cell infection dynamics for early M. tuberculosis infection success, and indicate that lung macrophages might crucially contribute to the early protection provided by pulmonary live TB vaccines. <br /

Estudio de la expresión, secreción y mecanismos inductores de apoptosis de los ligandos mortales en células hematológicas

Apo2L/TRAIL es un ligando mortal inductor de apoptosis vía extrínseca. Entre otras funciones, TRAIL, junto con FasL, son secretados asociados a exosomas y regulan la respuesta inmune. El objetivo de este trabajo ha sido profundizar en el papel de TRAIL en los procesos de regulación del sistema inmune. Se analizó la expresión de este ligando mortal así como su secreción y la contribución de TRAIL expresado en superficie o secretado a la capacidad citotóxica de linfocitos T normales activados obtenidos a partir de sangre periférica antes y después de ser reestimulados, comparándolo con la expresión y secreción en células tumorales de estirpe hematológica. También se analizó el efecto que tiene la inhibición de la proteína VCP (valosin-containing protein) implicada en la secreción de exosomas en células de origen tumoral mediante el uso de un inhibidor específico, DeBQ. Por último, se generaron líneas celulares tumorales de estirpe hematológica provenientes de mieloma múltiple resistentes a TRAIL para profundizar en el estudio de los mecanismos de resistencia que las células tumorales desarrollan frente a este ligando mortal. Se vieron diferencias entre los patrones de expresión de TRAIL en superficie e intracelular entre la línea celular tumoral Jurkat y los linfocitos T normales activados (blastos T) así como entre las subpoblaciones de blastos T CD4+ y CD8+. Se observó que la contribución principal de los ligandos mortales a la citotoxicidad de los blastos T se realiza a través de su secreción asociada a exosomas, sin apenas contribución de los ligandos mortales de superficie. Por último se vio que el inhibidor de la proteína VCP DeBQ utilizado a dosis subtóxica fue capaz de inhibir la expresión de TRAIL en superficie en la línea celular tumoral Jurkat pero no en blastos T, indicando que el DeBQ podría inhibir los mecanismos de transporte de TRAIL a superficie. Finalmente, se vio que uno de los mecanismos de adquisición de resistencia a TRAIL en líneas hematológicas provenientes de mieloma múltiple fue la disminución de la expresión de DR5 (receptor pro-apoptótico de TRAIL) en superficie

Metabolismo glucídico de los tumores y distintas aproximaciones de terapia antitumoral

La remodelación del metabolismo energético es una de las características biológicas que presentan las células tumorales, pasando de obtener energía a través de la fosforilación oxidativa a obtenerla mediante la fermentación láctica, incluso en presencia de oxígeno, fenómeno conocido como efecto Warburg. Este hecho puede ser aprovechado para emplearlo como diana antitumoral, mediante el uso de fármacos metabólicos. En este trabajo, por una parte, se han utilizado los fármacos dicloroacetato (DCA) y metformina para sensibilizar a tumores de origen hematológico a la acción citotóxica de linfocitos T citotóxicos (CTL) y células NK expandidas y activadas in vitro. El DCA susceptibiliza a la acción de eCTL y eNK a las células de mieloma múltiple MM.1S, que expresan p53 wild type, pero en las células de leucemia linfocítica crónica de tipo B (B-CLL) Mec-1 WT y Mec-1 Bcl-xL, que expresan p53 mutado, el efecto es el contrario. La susceptibilización de las células MM.1S en este caso depende del aumento en la expresión de ICAM-1, así como del aumento en la expresión de DR5 y de la acción de TRAIL en el caso de las eNK. La metformina, por su parte, susceptibiliza a las células Mec-1 WT y Mec-1 Bcl-xL a la acción de eNK y eCTL, pero no así a las células MM.1S. La susceptibilización en este caso depende de la línea celular y de la célula efectora, viéndose implicados LFA-1-ICAM-1, TRAIL y sus receptores y el sistema PD-1-PD-L1. El DCA también fue capaz de sensibilizar a tumores hematológicos, tanto in vitro como en muestras de pacientes de B-CLL, a la acción del fármaco ibrutinib, un inhibidor de la tirosina quinasa de Bruton. Además de esto, se ha estudiado la correlación entre el metabolismo glucídico de los tumores y su agresividad usando como modelo la línea celular L929dt, derivada del fibroblasto de ratón L929, que sufrió un proceso espontáneo de pérdida de adhesión a la placa de cultivo. Los resultados demuestran que los defectos en las mitocondrias de las células L929dt les conducen a una remodelación completa de su metabolismo, favoreciendo la pérdida de la adhesión, la resistencia al estrés oxidativo y un mayor fenotipo tumorigénico y metastásico.<br /

Efecto de fármacos metabólicos sobre la capacidad anti-tumoral de células inmunitarias.

En los últimos años, los fármacos metabólicos dicloroacetato (DCA) y metformina han ganado relevancia como agentes anti-tumorales gracias a su capacidad de interferir en el metabolismo energético tumoral. Asimismo, estudios previos han demostrado que estos fármacos pueden actuar contra el cáncer como agentes sensibilizadores a tratamientos de inmunoterapia, entre los que se halla la Terapia Celular Adoptiva (ACT). No obstante, su efecto directo sobre las propias células inmunitarias no se ha explorado en profundidad en la literatura. Por ello, este trabajo se ha centrado en los efectos directos de ambos fármacos sobre la proliferación y capacidad citotóxica de diversas células inmunitarias: células Natural Killer (NK) y Linfocitos T Citotóxicos (CTL) aisladas a partir de expansiones de células mononucleares en sangre periférica (eCTL, eNK), así como la línea celular NK-92.A partir de dichas expansiones, se pudieron obtener células eNK y eCTL con capacidad citotóxica sobre tumores. En los ensayos in vitro realizados, la incubación con el fármaco metformina afectó negativamente tanto a la proliferación de eCTL y eNK como a la capacidad citotóxica de las células eNK. Por su parte, el fármaco DCA no tuvo efecto negativo sobre la proliferación celular y permitió aumentar considerablemente la capacidad citotóxica de las eCTL, incluso frente a una línea celular de leucemia resistente a la apoptosis (Mec-1 Bcl-xL). En el caso de las células NK-92, que mostraron alta capacidad citotóxica ya desde ratios célula efectora:diana reducidos, la incubación con fármacos metabólicos no reportó efectos positivos ni en su crecimiento ni en su capacidad citotóxica frente a tumores. De manera general, los resultados de este estudio permiten enfatizar que el uso de fármacos metabólicos no solamente afecta a la población de células neoplásicas, sino también al crecimiento y al potencial anti-tumoral de las células inmunitarias que la combaten.<br /

Respuesta celular frente a alérgenos frutales

La alergia alimentaria es una patología crónica que afecta entre el 3% y el 6% de la población mundial, llegando a aumentar hasta un 8% en los niños. Es ocasionada por una respuesta exagerada y errónea del sistema inmunitario del paciente al verse expuesto a determinados alérgenos de origen alimentario. Es capaz de afectar a un gran número de sistemas del organismo, dando lugar a una amplia variedad de síntomas que van desde una leve urticaria hasta la anafilaxia, que puede llegar a ser mortal sin atención médica urgente. Entre los alérgenos alimenticios más comunes se encuentran los alérgenos vegetales, causantes de más del 70% de las alergias inducidas por alimentos. Y, entre los vegetales, las responsables de casi el 60% de las reacciones inducidas por frutas son las frutas de la familia de las rosáceas como el melocotón o la manzana. En España, la manzana tiene uno de los mayores ratios de reacciones sistémicas graves (>35%), por lo que supone un importante problema de salud pública. En este estudio nos centraremos en la proteína más alergénica de la manzana, una proteína transportadora de lípidos (LTP) denominada Mal d 3.El objetivo principal será comprobar si es posible imitar la respuesta propia de la alergia en cultivos in vitro. Para ello, se establecieron cultivos de células mononucleares de sangre periférica procedentes de pacientes alérgicos o de donantes sanos como control, y se determinaron a días 0, 4 y 6 de cultivo el porcentaje de linfocitos T CD4+ y de linfocitos B y la viabilidad celular en presencia o ausencia del alérgeno en cuestión. Además, a días 4 y 6 se midió la producción de IL-4 y de IL-5 (interleucinas características de la alergia). Como segundo objetivo del trabajo se analizó la posible disminución de la capacidad alergénica de la proteína tras un procesamiento enzimático que da lugar a la pérdida de su estructura. En los resultados se observó una gran capacidad intrínseca de supervivencia tanto en las células B como en las células T CD4+ procedentes de los pacientes alérgicos. Asimismo, se observó una gran producción de IL-5 en pacientes alérgicos a nivel basal y al exponer los cultivos al alérgeno en estado nativo que no se vio en presencia del alérgeno proteolizado o de la enzima responsable de la proteólisis.<br /

Células NK para el tratamiento del Mieloma Múltiple. Efecto del Dinaciclib

El mieloma múltiple (MM) es un tipo de cáncer hematológico que se caracteriza por laproliferación descontrolada de las células plasmáticas. Entre sus bases genéticas destacan laadquisición de hiperdiploidías y las traslocaciones que afectan al gen de la cadena pesada de lainmunoglobulina (IgH), llevando a su sobreexpresión. Dado que ninguno de los tratamientosactualmente aprobados resulta completamente curativo, ha sido necesario el desarrollo de nuevasterapias para hacer frente a la gran heterogeneidad que presenta esta enfermedad. Entre ellasdestaca Dinaciclib, un inhibidor de quinasa dependientes de ciclinas (CDK) que actúadesregulando el ciclo celular, o las terapias basadas en células NK.Basándonos en resultados previos del grupo de investigación se planteó la idea decombinar las dos terapias nombradas para comprobar una posible sinergia resultante entre ellas.Se analizó la muerte celular producida al incubar dos líneas celulares de MM tratadas conDinaciclib a distintas concentraciones junto a células NK-92-CD16 a distintos ratios de célulasefectoras-diana y tiempos de incubación. Para potenciar el efecto citotóxico de las célulasefectoras se adicionó Daratumumab, un anticuerpo monoclonal anti-CD38 aprobado para eltratamiento del MM.Los resultados obtenidos muestran que las células NK-92-CD16 ejercen por sí mismasun potente efecto citotóxico que aumenta al añadir Daratumumab. Aunque en algunos casos seobserva una tendencia hacia una mayor citotoxicidad al combinar Dinaciclib con las células NK-92-CD16, los efectos no llegaron a ser estadísticamente significativos. Estos efectos secontrastaron en muestras primarias de pacientes de MM. También se observó que, ante unarecaída de la enfermedad, estos se volvían más resistentes a los tratamientos con células NK-92-CD16. Aunque las condiciones ensayadas no llegan a generar sinergia, no se descarta que otrascombinaciones de quimioterapia con células NK puedan lograrlo.<br /

INMUNOTOXINAS DE LA GRANULISINA PARA EL TRATAMIENTO DEL CANCER

La granulisina es una proteína que en el organismo es producida por linfocitos T y las células asesinas naturales. La forma recombinante de 9kDa presenta actividad citotóxica contra ciertos microbios y en líneas celulares tumorales. Esto es debido a que presenta una activación de la vía de la apoptosis celular. Estudios realizados previamente sugieren la posibilidad de que GRNLY tendrá relevancia futura en la prevención de infecciones futuras y de cáncer.En este trabajo y utilizando las bases sentadas por nuestro grupo en la utilización de granulisina contra las células tumorales. Se ha pretendido producir una inmunotoxina (una proteína quimérica recombinante) en la que se fusionaban la granulisina de 9kDa con el scFv anti-tn AR20.5 en la levadura Pichia pastoris. En esta levadura se realizan producciones de proteinas recombinantes con modificaciones postraduccionales solubles y correctamente plegadas.Para ello se utilizó el plásmido pPICZα C, con el cDNA tanto de la proteína como del anticuerpo, generando el plásmido pPICZα C-AR20.5GRNLY. Se induce la expresión de la proteína con metanol una vez seleccionadas las cepas que han integrado el plásmido. La proteína se purificó partiendo del sobrenadante del cultivo y la realización de PEG a las colonias de levadura, mediante cromatografía de afinidad con níquel ya que se le añade a la quimera una cola de histidinas para facilitar este proceso. Una vez purificada la proteína se ensayó la unión del anticuerpo unido a la proteína al antígeno tn, dando resultados variables en diversas líneas celulares y una gran unión a la línea CAPAN-2. Se realizaron también diversos ensayos de bio actividad y se relacionaron estos ensayos con la citotoxicidad de la granulisina recombinante y la unión previamente ensayada al antígeno tn. Se demostró que a través de la unión a tn la inmunotoxina activa la muerte celular, por vía distinta a la apoptótica, dependiente de dosis y relacionado con la citotoxicidad de la propia granulisina. Con estos resultados se puede sentar una base para la producción de esta proteína y su utilización en ensayos in vivo previos a una posible utilización en clínica en diversos tumores.<br /

Estudio genético de células NK expandidas para el tratamiento de la leucemia linfocítica crónica de células B

La leucemia linfocítica crónica de células B (LLC-B) es un tumor hematológico causado por la acumulación de linfocitos B maduros y tumorales en sangre periférica, médula ósea y órganos linfoides secundarios. Durante muchas décadas para su tratamiento se han utilizado diferentes aproximaciones quimioterápia como agentes alquilantes, análogos de purinas o cortiocoesteroides. La desventaja de estos fármacos es que presentan una gran cantidad de efectos secundarios, es por ello que se ha intentado investigar la inmunoterapia como un tratamiento más selectivo y efectivo para combatir este tipo de tumores, utilizando por ejemplo anticuerpos contra ciertos antígenos tumorales. Sin embargo se ha generado múltiples resistencias contra estos anticuerpos, es por ello que más recientemente se han propuesto nuevas posibilidades como la utilización de células NK de donantes alogénicos sometidas a un proceso de activación y expansión. Nuestro grupo ha puesto a punto un protocolo de expansión de células NK humanas y estas células activadas y expandidas se han ensayado frente a células de 38 pacientes de LLC-B. En algunos pacientes se ha observado el desarrollo de resistencias a la citotoxicidad de las células NK expandidas, una causa para explicar esta resistencia podría deberse a la compatibilidad del HLA-I del paciente con los receptores de inhibición KIR de las células NK del donante empleado en cada caso. El objetivo de este trabajo es determinar si la resistencia generada se debe a este hecho, y así mismo estudiar los cambios producidos en el transcriptoma tras el procedimiento de activación y expansión

Efecto del DCA y de inhibidores de tirosín quinasas sobre células tumorales con mutaciones en el DNA mitocondrial

En trabajos anteriores se había demostrado mediante el estudio de su quinoma que la línea celular L929dt, la cual se generó de forma espontánea en nuestro laboratorio hace años, tenía una actividad exacerbada de las actividades proteín tirosín quinasa (PTK) respecto a sus parentales L929 (fibroblastos de ratón). Las células L929dt, a diferencia de las células L929 parentales, exhiben mutaciones en el DNA mitocondrial, crecen en suspensión y tienen un metabolismo de tipo fermentativo. La dependencia de la actividad PTK en este modelo in vitro de células metastásicas (L929dt) se demostró por su sensibilidad a la genisteína, un inhibidor general de PTK. Uno de los sustratos que exhibían una mayor diferencia en su fosforilación entre las células L929 y L929dt era la quinasa de adhesión focal (FAK). En este trabajo se ha estudiado si su inhibición farmacológica con defactinib podría afectar de forma diferencial a las células L929dt. Los resultados obtenidos demuestran la localización nuclear de FAK en las células L929dt y sugieren que la inhibición de la actividad quinasa de FAK no es especialmente relevante para eliminar estas células, ya sea como monoterapia o en combinación con el fármaco antimetabólico dicloroacetato (DCA).<br /