Sensitive Immunofluorescent Detection of the PRAME Antigen Using a Practical Antibody Conjugation Approach

Bioconjugation of antibodies with various payloads has diverse applications across various fields, including drug delivery and targeted imaging techniques. Fluorescent immunoconjugates provide a promising tool for cancer diagnostics due to their high brightness, specificity, stability and target affinity. Fluorescent antibodies are widely used in flow cytometry for fast and sensitive identification and collection of cells expressing the target surface antigen. Nonetheless, current approaches to fluorescent labeling of antibodies most often use random modification, along with a few rather sophisticated site-specific techniques. The aim of our work was to develop a procedure for fluorescent labeling of immunoglobulin G via periodate oxidation of antibody glycans, followed by oxime ligation with fluorescent oxyamines. Here, we report a novel technique based on an in situ oxime ligation of ethoxyethylidene-protected aminooxy compounds with oxidized antibody glycans. The approach is suitable for easy modification of any immunoglobulin G, while ensuring that antigen-binding domains remain intact, thus revealing various possibilities for fluorescent probe design. The technique was used to label an antibody to PRAME, a cancer-testis protein overexpressed in a number of cancers. A 6H8 monoclonal antibody to the PRAME protein was directly modified with protected-oxyamine derivatives of fluorescein-type dyes (FAM, Alexa488, BDP-FL); the stoichiometry of the resulting conjugates was characterized spectroscopically. The immunofluorescent conjugates obtained were applied to the analysis of bone marrow samples from patients with oncohematological diseases and demonstrated high efficiency in flow cytometry quantification. The approach can be applied for the development of various immunofluorescent probes for detection of diagnostic and prognostic markers, which can be useful in anticancer therapy

Branched Linkers for Site-Specific Fluorescent Labeling of Antibodies

Fluorescent antibodies have proved to be an invaluable tool for molecular biology and diagnostics. They are routinely produced by modification of lysine residues, which leads to high heterogeneity. As such, their affinity may be compromised if the antigen-binding site is affected, the probability of which increases along with the degree of labeling. In this work, we propose a methodology for the synthesis of site-specific antibody-dye conjugates with a high degree of labeling. To this end, we synthesized two oxyamine-based branched triazide linkers and coupled them with a periodate-oxidized anti-PRAME antibody 6H8; two oxyamine-based linear monoazide linkers of similar structure were used as controls. The azide-labeled antibodies were subsequently conjugated with fluorescent dyes via SPAAC, a copper-free click reaction. Compared to their counterparts made with linear linkers, the branched conjugates possessed a higher degree of labeling. The utility of the methodology was demonstrated in the detection of the PRAME protein on the surface of the cell by flow cytometry

Содержание нейроспецифических пептидов, маркеров нейромессенджера и нейрорецептора в сыворотке крови детей с вариативными сенсорными расстройствами, легкими когнитивными нарушениями и другой нейропатологией

Background. The role of recently discovered neurospecific peptides in the pathogenesis of acute and progressive neurologic disorders, their neuroprotective features, and possibilities to use them as markers for the course and prognosis of certain diseases have been actively studied in recent decades. However, neurospecific peptides are almost not studied in chronic residual diseases. In our study we measured the levels of neurospecific peptides and some other markers to achieve understanding of general neurophysiological trends in congenital and acquired chronic non-progressive brain pathology with reference to the selection of relevant groups — study objects. Objective. The aim of the study is to study patterns of neurospecific peptides, neurotransmitters and neuroreceptor markers distribution in the serum of children with various pathogenetic variants of chronic neuropathology. Methods. The study included children from 3 to 16 years old with different pathologies. The sample was divided into groups by pathology type: no sensory and neurological disorders, congenital sensory deficit due to mutation of genes expressed and not expressed in the brain, early acquired sensory deficit of multifactorial nature, congenital mild and severe organic disorders of central nervous system (CNS) in residual stage without baseline sensory deficit, acquired functional CNS disorders without baseline organic defect and sensory deficit. The following laboratory data (neurophysiological components) was studied: nerve growth factor, brain-derived neurotropic factor, neurotrophin-3, neurotrophin-4, neuregulin-1-beta-1, beta-secretase, sirtuin-1, synaptophysin, neuronal nitric oxide synthase, and anti-NR2 glutamate receptor antibodies. The parameters of cognitive activity, sense of vision, sense of smell, and acoustic sense were also evaluated. Results. The study included 274 participants. Neuropeptides and markers have shown a variable degree and range in the group spectrum of differences from normal levels. The most variable in the examined sample was NO-synthase, as well as levels of both neurotrophins, beta-secretase, and glutamate receptor marker. All visual deficits were associated with increased NO-synthase levels (p < 0.001). Neuroplasticity peptides (beta-secretase, neurotrophin-3 and 4) have been activated in all pathological conditions. Nerve growth factor and brain-derived neurotropic factor were specifically activated in mild organic CNS lesions (mild cognitive impairments), while neuregulin — in congenital genetically determined visual deficits. There was no specific activation of neuropeptides and NO-synthase level tended to decrease in cases of severe CNS lesions. Conclusion. The study results suggest that all types of early visual impairment are associated with increased physiological neuronal activity, and non-organic neurological functional disorders — mainly with increased physiological synaptic activity. General neuroplasticity processes were activated in all cases of visual deficits but more specific. However, more specific and well-studied processes were activated in mild organic CNS lesions, and neuroplasticity processes did not activate adequately in severe organic CNS lesions probably due to the limited neuronal and synaptic resources.Обоснование. В последние десятилетия активно исследуются вклад недавно открытых нейроспецифических пептидов в патогенез ряда острых и прогрессирующих заболеваний нервной системы, их нейропротективные свойства и возможности их использования для маркирования течения и прогноза некоторых заболеваний. При этом нейроспецифические пептиды почти не изучаются при хронических резидуальных состояниях. В нашем исследовании мы использовали определение уровней нейроспецифических пептидов и некоторых других маркеров для достижения понимания генеральных нейрофизиологических тенденций при врожденной и приобретенной хронической непрогрессирующей патологии мозга на основании подбора соответствующих групп — объектов исследования. Цель исследования — изучить закономерности распределения комплекса нейроспецифических пептидов, маркеров нейромессенджера и нейрорецептора в сыворотке крови детей с различными патогенетическими вариантами хронической нейропатологии. Методы. В исследование были включены дети с различной патологией в возрасте от 3 до 16 лет. Выборка была поделена на группы по типу патологии: отсутствие сенсорных и неврологических нарушений, врожденный сенсорный дефицит вследствие мутации генов, экспрессируемых и не экспрессируемых в мозге, рано приобретенный сенсорный дефицит полиэтиологической природы, врожденные легкие и тяжелые органические нарушения функций центральной нервной системы (ЦНС) в резидуальной стадии без исходного сенсорного дефицита, приобретенные функциональные расстройства ЦНС без исходного органического дефекта и сенсорного дефицита. В батарею измеряемых лабораторно в крови нейрофизиологических компонентов включили фактор роста нервов, нейротрофический фактор мозга, нейротрофин-3, нейротрофин-4, нейрегулин-1-бета-1, бета-секретазу, сиртуин-1, синаптофизин, нейрональную синтазу оксида азота и антитела к глутаматному рецептору NR2. Также оценивались параметры когнитивной деятельности, зрения, обоняния и слухового восприятия. Результаты. В исследование включены 274 участника. Установлено, что нейропептиды и маркеры показали вариативную степень и широту по групповому спектру отличий от нормы. Наиболее изменчивой в обследуемой выборке показала себя NO-синтаза, также часто различались уровни обоих нейротрофинов, бета-секретазы и маркера рецептора глутамата. При любых дефицитах зрения с большой достоверностью был повышен уровень NO-синтазы (р < 0,001). При всех патологических состояниях активировались пептиды нейропластичности — бета-секретаза, нейротрофины-3 и -4. При легких органических поражениях ЦНС (легкие когнитивные нарушения) специфично активировались фактор роста нервов и мозговой нейротрофический фактор, а при врожденных генетически детерминированных зрительных дефицитах специфично активировался нейрегулин. При тяжелых поражениях ЦНС специфической активации нейропептидов не определялось, а уровень NO-синтазы демонстрировал тенденцию к снижению по сравнению с нормой. Заключение. Результаты исследования позволяют предположить, что при всех типах раннего слабовидения происходит повышенная напряженность физиологической нейрональной деятельности, а при неорганических неврологических функциональных расстройствах — преимущественно повышение физиологической синаптической активности. При всех дефицитах зрения активированы процессы общей нейропластичности, но более специфические и изученные из них активируются при легких органических поражениях ЦНС, при тяжелых же органических поражениях ЦНС процессы нейропластичности недостаточно активны, вероятно, вследствие ограниченности нейрональных и синаптических ресурсов