Fine-mapping and SNP-analysis of putative QTLs in human muscle strength: the Leuven Genes for Muscular Strength Study

Musculaire fitheid vormt een belangrijke parameter in de gezondheidsgerelateerde fitheid. Voldoende spierkracht stelt ons immers niet alleen in staat om onze dagelijkse activiteiten zonder problemen uit te voeren of om recreatief of professioneel te sporten, maar heeft ook een belangrijke positieve invloed op onze gezondheid. Bijkomend speelt het spiermetabolisme een rol in de ontwikkeling, en daardoor ook de preventie, van tal van pathologische aandoeningen en chronische ziekten zoals diabetes, osteoporose, of hart- en vaatziekten. Studies hebben aangetoond dat de hoeveelheid spierkracht bepaald wordt door een combinatie van omgevingsfactoren zoals training, voeding of sociale status, genetische factoren en de interactie tussen beide. De Leuvense Genen voor Spierkracht studie (LGfMS) werd opgestart met als doel het identificeren van deze genetische factoren die (een deel van) de inter-individuele verschillen in humane spierkracht kunnen verklaren. De hoofdvraagstelling binnen dit doctoraatsproject was het uitwerken van een fijnmappingsstrategie en deze vervolgens toe te passen op twee reeds geïdentificeerde koppelingsregio s op chromosoom 12 (chr12q12-14 en chr12q22-23). Anderzijds hebben we in een tweede vraagstelling de relatie tussen genvarianten in het vitamine D receptor (VDR) gen en humane spierkracht bestudeerd. Voor het fijnmappen van de koppelingsregio s werd eerst een twee-staps empirische strategie ontwikkeld voor de selectie van kandidaatgenen en genvarianten in deze regio s. In een eerste stap werden de genen in de 1-LOD regio s van de koppelingspieken gerangschikt op basis van hun gelijkenis met genen waarvan gekend is dat ze spierkracht beïnvloeden, gebruik makend van Endeavour software. Deze rankschikking werd uitgevoerd voor 5 verschillende referentiesets van genen en gecombineerd tot één globale rangschikking. Vervolgens werden de 30 hoogst gerangschikte kandidaatgenen van elke referentieset en de globale rangschikking geselecteerd en aangevuld met genen die ondanks hun biologische evidentie voor een rol in spierkracht niet weerhouden werden op basis van hun rangschikking. Voor de genen die tot expressie komen in de skeletspier werden taggingSNPs bepaald op basis van het linkage disequilibrium tussen de genvarianten m.b.v. Tagger software gebruik makend van de CEPH (Centre d'Etude du Polymorphisme Humain) genotype data beschikbaar vanuit het HapMap project (Hoofdstuk 1). Deze taggingSNPs werden gegenotypeerd in een groep van 500 jong-volwassen broers (17-35j). Via gecombineerde koppelings- en associatieanalyses en familie-specifieke associatie analyses werd de relatie van deze polymorfismen met spierkracht van de knie nagegaan. Voor enkele veelbelovende genen werden bijkomende polymorfismen geselecteerd op basis van hun mogelijkheid om mRNA expressie of eiwitstructuur te beïnvloeden (vb SNPs in coderende regio s, in transcriptie factor bindingsplaatsen of in geconserveerde gebieden). Deze polymorfismen werden gegenotypeerd in een grotere groep van 536 broers. Binnen de 12q12-14 regio leidden deze analyses tot de identificatie van activin receptor 1B (ACVR1B), een receptor uit de transforming growth factor beta reactieweg (TGFbeta) die ook kan instaan voor de signaaltransductie van myostatine, een negatieve regulator van spiermassa. Een veelbelovende associatie werd gevonden met het rs2854464 polymorfisme, gelegen in een bindingsplaats voor miRNA-24. Voor dit miRNA-24 werd onlangs aangetoond dat het de ACVR1B expressie kan beinvloeden en dat het betrokken is bij de inhibitie van spierceldifferentatie door TGFbeta. Desondanks werden in een onafhankelijke groep van jonge mannen (N = 16) geen verschil in mRNA expressie tussen rs2854464 genotype groepen geobserveerd (Hoofdstuk 2). Binnen de 12q22-23 regio was rs3026468, gelegen in een sarcoplasmatisch reticulum calcium ATPase (ATP2A2) gen geassocieerd met spierkracht. Bijkomend werd voor twee andere SNPs (rs4630352 en rs1860561) aangetoond dat ze ATP2A2 mRNA expressie beïnvloeden (GG homozygoten gemiddeld 38% en 44% hogere expressie dan dragers van het A allel; p = 0.015 en 0.005) in een onafhankelijke groep van jonge mannen (N = 23). Bijkomend onderzoek is echter noodzakelijk om de rol van ATP2A2 en van deze drie polymorfismen in de determinatie van humane spierkracht te bevestigen (Hoofdstuk 3). Naast deze verdere verfijning van de koppelingsregio s op chromosoom 12, werd in de tweede vraagstelling binnen dit werk ook de relatie tussen genvarianten in het vitamine D receptor (VDR) gen en spierkracht nagegaan. Andere onderzoekers toonden reeds aan dat bepaalde genvarianten in VDR spierkracht kunnen beïnvloeden maar deze resultaten waren niet altijd eenduidig en vaak beperkt tot mannen of vrouwen of tot een specifieke leeftijdsgroep. We onderzochten de associatie van de BsmI, TaqI en FokI genvarianten met kniespierkracht in een groep van 253 mannen (54.9±10.2j) en 240 vrouwen (41.5±13.2j) uit een studie van het Steunpunt Sport, Beweging en Gezondheid. We observeerden dat vrouwen met een f/f genotype een sterkere quadriceps hebben dan F allel dragers. Mannen met een Bt/Bt haplotype zijn dan weer sterker dan de bT haplotype dragers. We kunnen dan ook besluiten dat dit werk bijgedragen geeft tot het ontrafelen van (een deel van) de genetische factoren die de een invloed hebben op de inter-individuele variatie in spierkracht in een gezonde populatie. Het fijnmappen van eerder geïdentificeerde koppelingsregio s op chromosoom 12 resulteerde in de identificatie van ACVR1B en mogelijks ATP2A2 als genen voor spierkracht. Bijkomend werd ook een geslachtspecifiek effect van VDR genvarianten op spierkracht geobserveerd. Voor alle associaties is bijkomend onderzoek naar de functionaliteit van het betrokken gen/polymorfisme wenselijk.status: publishe

Protective role of {alpha}-actinin-3 in the response to an acute eccentric exercise bout

The ACTN3 gene encodes for the alpha-actinin-3 protein, which has an important structural function in the Z-line of the sarcomere in fast muscle fibers. A pre-mature stop codon (R577X) polymorphism in the ACTN3 gene causes a complete loss of the protein in XX homozygotes. This study investigates a possible role for the alpha-actinin-3 protein in protecting the fast fiber from eccentric damage and studies repair mechanisms after a single eccentric exercise bout. Nineteen healthy young men (10 XX, 9 RR) performed 4 series of 20 maximal eccentric knee extensions with both legs. Blood (Creatine Kinase; CK) and muscle biopsy samples were taken to study differential expression of several anabolic (MyoD1, myogenin, MRF4, Myf5, IGF-1), catabolic (myostatin, MAFbx and MURF-1) and contraction-induced muscle damage marker genes (CSRP3, CARP, HSP70, IL-6) as well as a calcineurin signaling pathway marker (RCAN1). Baseline mRNA content of CSRP3 and MyoD1 was 49+/-12% and 67+/-25% higher in the XX group compared to RR (p=0.01-0.045). However, satellite cell number was not different between XX or RR individuals. Following eccentric exercise, XX individuals tended to have higher serum CK activity (p=0.10) and had higher pain scores than RR individuals. However, CSRP3 (p=0.058) and MyoD1 (p=0.08) mRNA expression tended to be t higher after training in RR individuals compared to XX alpha-actinin-3 deficient subjects. This study suggests a protective role of alpha-actinin-3 protein in muscle damage after eccentric training and an improved stress-sensor signaling, although effects are small.status: publishe

Protective role of alpha-actinin-3 in the response to an acute eccentric exercise bout

Vincent B, Windelinckx A, Nielens H, Ramaekers M, Van Leemputte M, Hespel P, Thomis MA. Protective role of alpha-actinin-3 in the response to an acute eccentric exercise bout. J Appl Physiol 109: 564-573, 2010. First published May 27, 2010; doi: 10.1152/japplphysiol.01007.2009.-The ACTN3 gene encodes for the alpha-actinin-3 protein, which has an important structural function in the Z line of the sarcomere in fast muscle fibers. A premature stop codon (R577X) polymorphism in the ACTN3 gene causes a complete loss of the protein in XX homozygotes. This study investigates a possible role for the alpha-actinin-3 protein in protecting the fast fiber from eccentric damage and studies repair mechanisms after a single eccentric exercise bout. Nineteen healthy young men (10 XX, 9 RR) performed 4 series of 20 maximal eccentric knee extensions with both legs. Blood (creatine kinase; CK) and muscle biopsy samples were taken to study differential expression of several anabolic (MyoD1, myogenin, MRF4, Myf5, IGF-1), catabolic (myostatin, MAFbx, and MURF-1), and contraction-induced muscle damage marker genes [cysteine-and glycine-rich protein 3 (CSRP3), CARP, HSP70, and IL-6] as well as a calcineurin signaling pathway marker (RCAN1). Baseline mRNA content of CSRP3 and MyoD1 was 49 +/- 12 and 67 +/- 25% higher in the XX compared with the RR group (P = 0.01-0.045). However, satellite cell number was not different between XX and RR individuals. After eccentric exercise, XX individuals tended to have higher serum CK activity (P = 0.10) and had higher pain scores than RR individuals. However, CSRP3 (P = 0.058) and MyoD1 (P = 0.08) mRNA expression tended to be higher after training in RR individuals compared with XX alpha-actinin-3-deficient subjects. This study suggests a protective role of alpha-actinin-3 protein in muscle damage after eccentric training and an improved stress-sensor signaling, although effects are small

Alpha-actinin-3 deficiency does not significantly alter oxidative enzyme activity in fast human muscle fibres

AIM: In Western European populations, about 18% of all individuals have a complete deficiency of the alpha-actinin-3 protein owing to homozygosity for a stop codon mutation (R577X) in the ACTN3 gene. Actn3(-/-) knock-out mice show increased activity of multiple enzymes in the aerobic metabolic pathway in fast muscle fibres. Whether this observation is also present in human XX genotype carriers compared to RR carriers has not been studied in a fibre-type-specific approach in humans. The purpose of this study was therefore to compare fibre-type-specific oxidative enzyme activity in humans with a different ACTN3 R577X genotype. METHODS: Vastus lateralis muscle biopsy samples of 17 XX and 16 RR subjects were used to measure markers of oxidative capacity [cytochrome c oxidase (CYTOX) and succinate dehydrogenase (SDH)] in a fibre-type-specific assay using enzyme histochemistry. RESULTS: Cytochrome c oxidase staining showed no significant genotype group differences in type I or type II muscle fibres. Also, we found no significant differences in SDH staining of fast fibres comparing XX and RR carriers. CONCLUSION: In conclusion, the increase in oxidative enzyme activity of fast muscle fibres, as reported in an Actn3(-/-) knock-out mouse, was not observed in our human samples. Known differences in metabolic characteristics of muscle fibres in rodents compared to humans may in part explain this discrepancy in findings

Is PPARα intron 7 G/C polymorphism associated with muscle strength characteristics in nonathletic young men?

Peroxisome proliferator-activated receptor alpha (PPARα), a ligand-dependent transcription factor, regulates fatty acid metabolism in heart and skeletal muscle. The intron 7 G/C polymorphism (rs4253778) has been associated with athletic performance. The rare C-allele was predominant in power athletes, whereas the G-allele was more frequent in endurance athletes. In the present study, we investigated the association between this polymorphism and strength characteristics in nonathletic, healthy young adults (n = 500; age 24.2 ± 4.4 years). Knee torque was measured during concentric knee flexion and extension movements at 60°/s, 120°/s, and 240°/s during 3, 25, and 5 repetitions, respectively. Also, resistance to muscle fatigue (i.e. work last 20% repetitions/work first 20% repetitions *100) was calculated. Differences in knee strength phenotypes between GG homozygous individuals and C-allele carriers were analyzed. The polymorphism did not influence the ability to produce isometric or dynamic knee flexor or extensor peak torque during static or dynamic conditions in this population (0.23 < P < 0.95). Similar results were found for the endurance ratio, a measure for resistance to muscle fatigue. In conclusion, the PPARα intron 7 G/C polymorphism does not seem to influence strength characteristics in a nonathletic population.status: publishe

Genome-wide linkage scan for contraction velocity characteristics of knee musculature in the Leuven Genes for Muscular Strength Study

The torque-velocity relationship is known to be affected by ageing, decreasing its protective role in the prevention of falls. Interindividual variability in this torque-velocity relationship is partly determined by genetic factors (h2: 44–67%). As a first attempt, this genome-wide linkage study aimed to identify chromosomal regions linked to the torque-velocity relationship of the knee flexors and extensors. A selection of 283 informative male siblings (17–36 yr), belonging to 105 families, was used to conduct a genome-wide SNP-based (Illumina Linkage IVb panel) multipoint linkage analysis for the torque-velocity relationship of the knee flexors and extensors. The strongest evidence for linkage was found at 15q23 for the torque-velocity slope of the knee extensors (TVSE). Other interesting linkage regions with LOD scores >2 were found at 7p12.3 [logarithm of the odds ratio (LOD) = 2.03, P = 0.0011] for the torque-velocity ratio of the knee flexors (TVRF), at 2q14.3 (LOD = 2.25, P = 0.0006) for TVSE, and at 4p14 and 18q23 for the torque-velocity ratio of the knee extensors TVRE (LOD = 2.23 and 2.08; P = 0.0007 and 0.001, respectively). We conclude that many small contributing genes are involved in causing variation in the torque-velocity relationship of the knee flexor and extensor muscles. Several earlier reported candidate genes for muscle strength and muscle mass and new candidates are harbored within or in close vicinity of the linkage regions reported in the present study

Comprehensive fine mapping of chr12q12-14 and follow-up replication identify activin receptor 1B (ACVR1B) as a muscle strength gene

Muscle strength is important in functional activities of daily living and the prevention of common pathologies. We describe the two-staged fine mapping of a previously identified linkage peak for knee strength on chr12q12-14. First, 209 tagSNPs in/around 74 prioritized genes were genotyped in 500 Caucasian brothers from the Leuven Genes for Muscular Strength study (LGfMS). Combined linkage and family-based association analyses identified activin receptor 1B (ACVR1B) and inhibin β C (INHBC), part of the transforming growth factor β pathway regulating myostatin – a negative regulator of muscle mass – signaling, for follow-up. Second, 33 SNPs, selected in these genes based on their likelihood to functionally affect gene expression/function, were genotyped in an extended sample of 536 LGfMS siblings. Strong associations between ACVR1B genotypes and knee muscle strength (P-values up to 0.00002) were present. Of particular interest was the association with rs2854464, located in a putative miR-24-binding site, as miR-24 was implicated in the inhibition of skeletal muscle differentiation. Rs2854464 AA individuals were ∼2% stronger than G-allele carriers. The strength increasing effect of the A-allele was also observed in an independent replication sample (n=266) selected from the Baltimore Longitudinal Study of Aging and a Flemish Policy Research Centre Sport, Physical Activity and Health study. However, no genotype-related difference in ACVR1B mRNA expression in quadriceps muscle was observed. In conclusion, we applied a two-stage fine mapping approach, and are the first to identify and partially replicate genetic variants in the ACVR1B gene that account for genetic variation in human muscle strength