Pro-Resolving FPR2 Agonists Regulate NADPH Oxidase-Dependent Phosphorylation of HSP27, OSR1, and MARCKS and Activation of the Respective Upstream Kinases

Formyl peptide receptor 2 (FPR2) is involved in the pathogenesis of chronic inflammatory diseases, being activated either by pro-resolving or proinflammatory ligands. FPR2-associated signal transduction pathways result in phosphorylation of several proteins and in NADPH oxidase activation. We, herein, investigated molecular mechanisms underlying phosphorylation of heat shock protein 27 (HSP27), oxidative stress responsive kinase 1 (OSR1), and myristolated alanine-rich C-kinase substrate (MARCKS) elicited by the pro-resolving FPR2 agonists WKYMVm and annexin A1 (ANXA1)

Intranuclear Signaling Cascades Triggered by Nuclear GPCRs

G protein-couped receptors (GPCRs) play a key role on cellular membranes, where they respond to a broad array of extracellular signals such as lipids, peptides, proteins and sensory agents. Intracellular biological responses triggered by these receptors include hormone secretion, muscle contraction, cellular metabolism a tyrosine kinase receptors transactivation. Recent results indicate that GPCRs localize to and signal also at nuclear level, thus regulating distinct signaling pathways which can also result from the integration of extracellular and intracellular stimuli. Nuclear GPCRs play a central role in many cellular processes, including regulation of gene transcription, cellular proliferation, neovascularization and RNA synthesis. On nuclear membranes and in nucleoplasm are present all the downstream signal transduction components of GPCRs, including G proteins, adenylyl cyclase, and second messengers such as Ca++, ERKs, p38MAPK and other protein kinases. Nuclear GPCRs may be constitutively active or may be activated by ligands internalized from the extracellular space or synthesized within the cell. The translocation of membrane receptors to the nucleus could be attributed to the presence of a Nuclear Localization Signal, which is present in the eighth helix or in the third intracellular loop of a limited number of GPCRs. However, several sequence motifs that do not resemble classical Nuclear Localization Signals can promote import of GPCRs. In this review we discuss the most recent results on nuclear localization and signaling of several GPCRS

Formyl Peptide Receptor 1 Modulates Endothelial Cell Functions by NADPH Oxidase-Dependent VEGFR2 Transactivation

In the vasculature, NADPH oxidase is the main contributor of reactive oxygen species (ROS) which play a key role in endothelial signalling and functions. We demonstrate that ECV304 cells express p47phox, p67phox, and p22phox subunits of NADPH oxidase, as well as formyl peptide receptors 1 and 3 (FPR1/3), which are members of the GPCR family. By RT-PCR, we also detected Flt-1 and Flk-1/KDR in these cells. Stimulation of FPR1 by N-fMLP induces p47phox phosphorylation, which is the crucial event for NADPH oxidase-dependent superoxide production. Transphosphorylation of RTKs by GPCRs is a biological mechanism through which the information exchange is amplified throughout the cell. ROS act as signalling intermediates in the transactivation mechanism. We show that N-fMLP stimulation induces the phosphorylation of cytosolic Y951, Y996, and Y1175 residues of VEGFR2, which constitute the anchoring sites for signalling molecules. These, in turn, activate PI3K/Akt and PLC-γ1/PKC intracellular pathways. FPR1-induced ROS production plays a critical role in this cross-talk mechanism. In fact, inhibition of FPR1 and/or NADPH oxidase functions prevents VEGFR2 transactivation and the triggering of the downstream signalling cascades. N-fMLP stimulation also ameliorates cellular migration and capillary-like network formation ability of ECV304 cells

Regulation of inflammation and oxidative stress by formyl peptide receptors in cardiovascular disease progression

G protein-coupled receptors (GPCRs) are the most important regulators of cardiac function and are commonly targeted for medical therapeutics. Formyl-Peptide Receptors (FPRs) are members of the GPCR superfamily and play an emerging role in cardiovascular pathologies. FPRs can modulate oxidative stress through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase-dependent reactive oxygen species (ROS) production whose dysregulation has been observed in different cardiovascular diseases. Therefore, many studies are focused on identifying molecular mechanisms of the regulation of ROS production. FPR1, FPR2 and FPR3 belong to the FPRs family and their stimulation triggers phosphorylation of intracellular signaling molecules and nonsignaling proteins that are required for NADPH oxidase activation. Some FPR agonists trigger inflammatory processes, while other ligands activate proresolving or anti-inflammatory pathways, depending on the nature of the ligands. In general, bacterial and mitochondrial formylated peptides activate a proinflammatory cell response through FPR1, while Annexin A1 and Lipoxin A4 are anti-inflammatory FPR2 ligands. FPR2 can also trigger a proinflammatory pathway and the switch between FPR2-mediated pro- and anti-inflammatory cell responses depends on conformational changes of the receptor upon ligand binding. Here we describe the detrimental or beneficial effects of the main FPR agonists and their potential role as new therapeutic and diagnostic targets in the progression of cardiovascular diseases

Tumour-associated macrophages correlate with microvascular bed extension in colorectal cancer patients

Tumour-associated macrophages (TAMs) represent pivotal components of tumour microenvironment promoting angiogenesis, tumour progression and invasion. In colorectal cancer (CRC), there are no conclusive data about the role of TAMs in angiogenesis-mediated tumour progression. In this study, we aimed to evaluate a correlation between TAMs, TAM immunostained area (TAMIA) microvascular density (MVD), endothelial area (EA) and cancer cells positive to VEGF-A (CCP-VEGF-A) in primary tumour tissue of locally advanced CRC patients undergone to radical surgery. A series of 76 patients with CRC were selected and evaluated by immunohistochemistry and image analysis. An anti-CD68 antibody was employed to assess TAMs and TAMIA expression, an anti-CD34 antibody was utilized to detect MVD and EA expression, whereas an anti-VEGF-A antibody was used to detect CCP-VEGF-A; then, tumour sections were evaluated by image analysis methods. The mean ± S.D. of TAMs, MVD and CCP-VEGF-A was 65.58 ± 21.14, 28.53 ± 7.75 and 63% ± 37%, respectively; the mean ± S.D. of TAMIA and EA was 438.37 ± 124.14μ2 and 186.73 ± 67.22μ2, respectively. A significant correlation was found between TAMs, TAMIA, MVD and EA each other (r ranging from 0.69 to 0.84; P ranging from 0.000 to 0.004). The high level of expression of TAMs and TAMIA in tumour tissue and the significant correlation with both MVD and EA illustrate that TAMs could represent a marker that plays an important role in promoting angiogenesis-mediated CRC. In this context, novel agents killing TAMs might be evaluated in clinical trials as a new anti-angiogenic approach

Longevity of Replaced ICD/CRT-D

Longevity of Replaced ICD/CRT-D Introduction The longevity of defibrillators (ICD) is extremely important from both a clinical and economic perspective. We studied the reasons for device replacement, the longevity of removed ICD, and the existence of possible factors associated with shorter service life. Methods and Results Consecutive patients who underwent ICD replacement from March 2013 to May 2015 in 36 Italian centers were included in this analysis. Data on replaced devices were collected. A total of 953 patients were included in this analysis. In 813 (85%) patients the reason for replacement was battery depletion, while 88 (9%) devices were removed for clinical reasons and the remaining 52 because of system failure (i.e., lead or ICD generator failure or a safety advisory indication). The median service life was 5.9 years (25th–75th percentile, 4.9–6.9) for single- and dual-chamber ICD and 4.9 years (25th–75th percentile, 4.0–5.7) for CRT-D. On multivariate analysis, the factors CRT-D device, SC/DC ICD generator from Biotronik, percentage of ventricular pacing, and the occurrence of a system failure were positively associated with a replacement procedure. By contrast, the device from Boston Scientific was an independent protective factor against replacement. Considerable differences were seen in battery duration in both ICD and CRT-D. Specifically, Biotronik devices showed the shortest longevity among ICD and Boston Scientific showed the longest longevity among CRT-D (log-rank test, P < 0.001 for pairwise comparisons). Conclusion Several factors were associated with shorter service life of ICD devices: CRT-D, occurrence of system failure and percentage of ventricular pacing. Our results confirmed significant differences among manufacturers

Regolazione della NADPH ossidasi non fagocitica mediata dal recettore FPRL1: effetto delle specie reattive dell'ossigeno generate sulla regolazione dell'espressione genica

L'obiettivo di questo studio è stato: i) l' identificazione, in fibroblasti umani IMR90, delle kinasi responsabili della fosforilazione di p47phox e quindi del fine controllo della NADPH ossidasi non fagocitica; ii) l'analisi dell'espressione genica in seguito a modificazioni delle condizioni redox intracellulari indotte dal peptide WKYMVm. Abbiamo innanzitutto analizzato la capacità del peptide W di attivare PKC in cellule IMR90. L'attività di PKC negli estratti totali è stata misurata a 1 e 5 minuti dopo stimolazione dei fibroblasti umani deprivati di siero con 10 micromolare WKYMVm. I risultati hanno dimostrato che l'attività enzimatica, misurata come la capacità di fosforilare un peptide bersaglio contenente siti di fosforilazione di PKC, è rilevabile dopo 1 minuto ed aumenta significativamente dopo 5 minuti di esposizione a WKYMVm. E' stato dimostrato che le PKC attivate stimolano Ras, Raf e le ERK in diversi tipi cellulari e che l'attivazione delle ERK mediante TPA è prevenuta dagli inibitori di PKC. Inoltre, la fosforilazione delle ERK indotta da N-fMLP in neutrofili è inibita da GF109203X e dalla calphostina c. Abbiamo quindi analizzato se isoforme di PKC sensibili a GF109203X e a Go6983 sono coinvolte nella fosforilazione delle ERK in cellule IMR90 stimolate con WKYMVm. I risultati hanno mostrato che la preincubazione con GF109203X, che agisce come inibitore competitivo per il sito di legame all'ATP di PKC, o con Go6983 previene l'attivazione di ERK2 in maniera dose-dipendente. Poichè le PKC convenzionali sono attivate dal calcio e dal DAG mentre le PKC nuove sono calcio-insensibili, abbiamo anche analizzato gli effetti della deplezione del calcio intracellulare sulla attivazione delle ERK. I dati ottenuti hanno rivelato che la preincubazione con il chelante del calcio BAPTA-AM previene significativamente la fosforilazione delle ERKin maniera dose-dipendente. Questi risultati suggeriscono che isoforme di PKC calcio-dipendenti agiscono sulla regolazione della fosforilazione delle ERK, ma non possono escludere che anche isoenzimi di PKC calcio-indipendenti sono coinvolti. Abbiamo inoltre dimostrato che in cellule IMR90 stimolate con il peptide W, la preincubazione con GF109203X o con Go6983 previene la fosforilazione di p47phox e la sua traslocazione sulla membrana. Abbiamo anche analizzato il ruolo dei due inibitori di PKC nella attivazione della NADPH ossidasi mediata da WKYMVm. Membrane purificate da fibroblasti stimolati con il peptide W o preincubati con GF109203X o Go6983 prima della stimolazione, sono stati incubati con le corrispettive proteine citosoliche e cimentate in un saggio di riduzione del citocromo c sensibile alla SOD. I risultati hanno dimostrato che la generazione di superossido NADPH-dipendente è prevenuta dopo trattamento con GF109203X o Go6983. Sono stati successivamente analizzati gli isoenzimi di PKC attivati in seguito all'esposizione a WKYMVm investigando sulla loro compartimentalizzazione cellulare dopo la stimolazione. In risposta al peptide W, delle sette isoforme di PKC che abbiamo analizzato solo PKC-alfa e PKC-delta traslocano dalla frazione citosolica a quella di membrana ed un significativo aumento nelle quantità di queste isoforme nella frazione di membrana è osservabile dopo 1 minuto di trattamento. Poichè PKC-alfa e PKC-delta sono attivate in fibroblasti umani IMR90 stimolati con WKYMVm, si è proceduto ad analizzare gli effetti di Go6976, un inibitore selettivo degli isoenzimi calcio-dipendenti PKC-alfa e PKC-betaI, e della rottlerina, un inibitore selettivo dell'attività enzimatica di PKC-delta, sulla attivazione delle ERK e sulla fosforilazione e traslocazione di p47phox. Esperimenti di western blot ci hanno consentito di dimostrare che la preincubazione con Go6976 o con rottlerina causa una inibizione dose-dipendente della attivazione delle ERK nonchè previene l'assemblaggio della NADPH ossidasi, inibendo la fosforilazione e la traslocazione di p47phox

Identificazione dei meccanismi di attivazione di una NADPH ossidasi non fagocitica da parte dei formil peptidi

Scopo del presente progetto é stata la dettagliata caratterizzazione dei pathway molecolari implicati nell’attivazione della NADPH ossidasi espressa in fibroblasti umani dopo stimolazione con peptidi formilati (N-fMLP) e non, nonché l’analisi di geni differenzialmente espressi in seguito a tale trattamento. L’approccio sperimentale utilizzato in questi studi é consistito nella stimolazione di fibroblasti umani IMR90 deprivati di siero, che esprimono una macchina molecolare simile alla NADPH ossidasi, con concentrazioni e tempi diversi di N-fMLP che rappresenta un forte attivatore della NADPH ossidasi fagocitica. E’ stata valutata la capacità dei formil-peptidi di attivare l’ossidasi mediante saggi di attività enzimatica ed analisi, mediante western blot, della subunità regolatoria citosolica p47phox della NADPH ossidasi, I risultati ottenuti dimostano che in seguito a tale trattamento si osserva i) una rapida attivazione della NADPH ossidasi, inibibile dalla superossido dismutasi; ii) la fosforilazione e la traslocazione sulla membrana di p47phox, che rappresenta l' evento necessario richiesto per l’attivazione di questa macchina molecolare. Inoltre, la pre-incubazione con PD098059, un inibitore di MEK1, prima della stimolazione previene completamente i fenomeni osservati suggerendo il coinvolgimento delle ERK in questi eventi. Abbiamo infatti successivamente dimostrato che in fibroblasti umani IMR90 deprivati di siero, concentrazioni micromolari di N-fMLP inducono una rapida fosforilazione/attivazione di ERK1/2, misurata in esperimenti di western blot condotti con un anticorpo anti-fosfoERK e che questa è completamente prevenuta da PD098059. In cellule fagocitiche N-fMLP interagisce con almeno due tipi di recettore, uno ad alta affinità (FPR) e l’altro a bassa affinità (FPRL1), ed attiva una cascata di segnali, mediati da proteine G eterotrimeriche sensibili alla tossina della pertosse (PTX), che conduce alla migrazione cellulare, alla fagocitosi, al rilascio di mediatori pro-infiammatori ed alla generazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) via attivazione della NADPH ossidasi. Fibroblasti umani IMR90 deprivati di siero sono stati quindi preincubati con PTX prima della stimolazione con N-fMLP ed esperimenti condotti su estratti proteici purificati da queste cellule hanno dimostrato che PTX è in grado i) di inibire la fosforilazione delle ERK da parte del formil-peptide; ii) di prevenire l’attivazione NADPH-dipendente della NADPH ossidasi non fagocitica; iii) di inibire la fosforilazione e la traslocazione sulla membrana della subunità catalitica p47phox. Questi esperimenti suggeriscono che N-fMLP é capace di attivare la NADPH ossidasi via proteine G sensibili a PTX e che le cellule IMR90 esprimono recettori specifici per formil-peptidi. E’ stata quindi analizzata l’espressione in queste cellule del recettore FPR e FPRL1 mediante esperimenti di RT-PCR condotti su RNA totale purificato da cellule IMR90 ed utilizzando primer specifici. I risultati ottenuti hanno dimostrato che queste cellule esprimono soltanto il recettore a bassa affinità FPRL1 il quale é noto mostrare una più alta affinità per l’esapeptide WKYMVm (peptide W) rispetto a N-fMLP. Esperimenti condotti utilizzando il peptide W hanno infatti dimostrato la sua capacità di indurre una significativa attivazione delle ERK e la traslocazione sulla membrana di p47phox a concentrazioni più basse rispetto a quelle utilizzate per N-fMLP. Mediante saggi di legame al recettore, condotti con WKYMVm iodinato, é stato anche analizzato il legame specifico del peptide W su FPRL1. I risultati hannno dimostrato che sulla membrana dei fibroblasti umani sono espressi siti di legame per il peptide W i quali sono specificamente spiazzati da concentrazioni crescenti di peptide non marcato. Inoltre, l’analisi dei dati di binding hanno consentito di predirre una costante di dissociazione di 160 nM ed una densità di circa 16200 molecole di recettore/cellula. Tale recettore é biologicamente funzionale. Infatti, FPRL1, opportunamente clonato in un vettore di espressione eucariotica, é stato trasfettato in cellule HEK293 prima della stimolazione con N-fMLP (o con WKYMVm). Tali cellule esprimono NOX4, un membro della famiglia delle NADPH ossidasi non fagocitiche, ma non recettori per i formil-peptidi. La determinazione della produzione di anione superossido NADPH-dipendente, misurata come velocità di riduzione del citocromo c sensibile alla superossido dismutasi, ha dimostrato che in HEK293 trasfettate con FPRL1 è possibile misurare un significativo aumento di ROS, mentre nessun effetto è rivelabile nelle cellule trasfettate con il plasmide di controllo. Nelle cellule polimorfonucleate l’interazione tra i formil-peptidi ed i rispettivi recettori serpentinici accoppiati a proteine G eterotrimeriche attiva la fosfolipasi Cbeta che genera inositolo 1,4,5-trifosfato e diacil-glicerolo. La proteina kinasi C (PKC) così attivata é responsabile della fosforilazione di residui di serina (diversi da quelli che sono bersaglio delle ERK) della subunità regolatoria p47phox della NADPH ossidasi. E’ stato quindi valutato il ruolo delle PKC sull’attivazione della ossidasi non fagocitica in cellule IMR90, utilizzando inibitori specifici delle varie isoforme della famiglia di PKC (Go6983, Go6976, GF109203X e rottlerina). Go6976 inibisce preferenzialmente PKC alfa, beta e mu, Go6983 inibisce PKC alfa, beta, gamma, delta e teta, GF109203X inibisce PKC alfa, beta, delta, epsilon, teta e mu e la rottlerina é un inibitore abbastanza specifico per la PKC delta. Saggi di attivazione hanno dimostrato che in queste cellule la stimolazione con il peptide W fosforila un peptide substrato della PKC in maniera dose dipendente. Poiché PKC attivata stimola ERK, Ras e Raf in molti tipi cellulari é stato innanzitutto valutato il ruolo di questa kinasi sull’attivazione delle ERK in cellule IMR90 incubate con il peptide. I risultati ottenuti hanno dimostrato che il pretrattamento con Go6983, Go6976, GF109203X e rottlerina attenuano significamente la fosforilazione delle ERK in maniera dose-dipendente. Successivamente é stata analizzata la capacità di questi inibitori di prevenire l’attivazione della NADPH ossidasi. I risultati dimostrano che la rottlerina, Go6976 e GF109203X inibiscono la fosforilazione e la traslocazione sulla membrana di p47phox. In accordo, saggi di attività enzimatica condotti su frazioni di membrana e citosoliche in presenza di NADPH, FAD e ferricitocromo c, hanno dimostrato che tali inibitori prevengono anche la riduzione del citocromo c ad opera dell’anione superossido generato dalla NADPH ossidasi attivata dal peptide W. Sulla base dei risultati ottenuti é stata condotta una analisi mediante western blot per identificare le isoforme di PKC attivate dal peptide W e coinvolte nel processo di attivazione della ossidasi non fagocitica. I risultati ottenuti dimostrano che PKC delta, e non altre isoforme, si attiva traslocando sulla membrana dopo 2’ di incubazione con il peptide W e la sua attivazione é richiesta per il completo funzionamento della NADPH ossidasi. Infatti, saggi di produzione di ROS hanno dimostrato che la loro generazione da parte della ossidasi non fagocitica é prevenuta dall’incubazione con gli inibitori di PKC, in particolare dalla rottlerina

Formyl-peptide receptors, NADPH oxidase and replicative senescence

The formyl-peptide receptor family members FPR, FPRL1 and FPRL2, expressed in human cells, belong to pertussis toxin sensitive G-protein coupled seven transmembrane receptor family (GPCR). In polymorphonucleate cells (PMN) binding of small formyl-peptide derivatives, whose prototype is N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (N-fMLP), to these receptors triggers a complex program that results in cell migration, reorganization of the actin cytoskeleton and superoxide anion generation through NADPH oxidase activation. FPR and FPRL1 bind N-fMLP with high and low efficiency, respectively. FPRL2 does not respond to formyl-peptides and it was described as a low affinity receptor for several FPRL1 agonists. FPR and FPRL1 were initially detected in phagocytic leukocytes, while FPRL2 was described only in monocytes and in dendritic cells but in the last years many results demonstrate that several other cell types and tissues also express these receptors. In addition to N-fMLP, several nonformylated peptide agonists or other non-proteic ligands that preferentially activate either or both FPR and FPRL1 in nonphagocytic cells have been identified. They include WKYMVm peptide, isolated by screening a random oligonucleotide library, annexin 1, lipoxin A4 (LXA4), urokinase and its receptor, serum amyloid A, humanin and cathelicidin LL-37. Phagocytic NADPH oxidase activation and the subsequent reactive oxygen specie (ROS) generation represents one of the downstream target of the signaling cascade triggered by FPR and/or FPRL1. Proteins homologous to the membrane catalytic subunit gp91phox and to the cytosolic regulatory components p47phox and p67phox of NADPH oxidase also have been identified in nonphagocytic cells. Compared with PMN, much less is understood about the signal transduction pathways involved in the regulation of the activation of nonphagocytic NADPH oxidase, triggered by formyl-peptide receptors/agonist interaction. We demonstrated that human fibroblasts and epithelial cells express FPRL1 and an enzymatic machinery homologous to phagocytic NADPH oxidase. In serum-deprived cells, exposure to growth factors stimulates NADPH oxidase to generate superoxide anion and treatment with NADPH oxidase inhibitors results in impairment of the serum-induced signaling cascade. Furthermore, exposure to N-fMLP or to 10-fold lower concentration of WKYMVm for short times (1’) induces superoxide generation due to serine-phosphorylation and membrane translocation of the regulatory citosolic NADPH oxidase subunit p47phox. These effects are in large part mediated by the rapid activation of ERKs and are inhibited by pertussis toxin, suggesting the involvement of CPCRs. In addition to ERKs, in these cells exposed to N-fMLP or WKYMVm, p47phox phosphorylation and its translocation on membrane also requires Protein kinase C-α and -δ. On the other hand the exposure for longer times (up to 3hrs) induces p21waf1 accumulation, the block of the G1/S cycle, a significative increase of β-gal positive cells and the appearance of a senescent phenotype