An Approach to Study Melanoma Invasion and Crosstalk with Lymphatic Endothelial Cell Spheroids in 3D Using Immunofluorescence

Three-dimensional (3D) cell culture has allowed a deeper understanding of complex pathological and physiological processes, overcoming some of the limitations of 2D cell culture on plastic and avoiding the costs and ethical issues related to experiments involving animals. Here we describe a protocol to embed single melanoma cells alone or together with primary human lymphatic endothelial cells in a 3D crosslinked matrix, to investigate the invasion and molecular crosstalk between these two cell types, respectively. After fixation and staining with antibodies and fluorescent conjugates, phenotypic changes in both cell types can be specifically analyzed by confocal microscopy.Peer reviewe

Lymphatic endothelium stimulates melanoma metastasis and invasion via MMP14-dependent Notch3 and beta 1-integrin activation

Lymphatic invasion and lymph node metastasis correlate with poor clinical outcome in melanoma. However, the mechanisms of lymphatic dissemination in distant metastasis remain incompletely understood. We show here that exposure of expansively growing human WM852 melanoma cells, but not singly invasive Bowes cells, to lymphatic endothelial cells (LEC) in 3D co-culture facilitates melanoma distant organ metastasis in mice. To dissect the underlying molecular mechanisms, we established LEC co-cultures with different melanoma cells originating from primary tumors or metastases. Notably, the expansively growing metastatic melanoma cells adopted an invasively sprouting phenotype in 3D matrix that was dependent on MMP14, Notch3 and beta 1-integrin. Unexpectedly, MMP14 was necessary for LEC-induced Notch3 induction and coincident beta 1-integrin activation. Moreover, MMP14 and Notch3 were required for LEC-mediated metastasis of zebrafish xenografts. This study uncovers a unique mechanism whereby LEC contact promotes melanoma metastasis by inducing a reversible switch from 3D growth to invasively sprouting cell phenotype.Peer reviewe

Lymphatic endothelium stimulates melanoma metastasis and invasion via MMP14-dependent Notch3 and beta 1-integrin activation

Lymphatic invasion and lymph node metastasis correlate with poor clinical outcome in melanoma. However, the mechanisms of lymphatic dissemination in distant metastasis remain incompletely understood. We show here that exposure of expansively growing human WM852 melanoma cells, but not singly invasive Bowes cells, to lymphatic endothelial cells (LEC) in 3D co-culture facilitates melanoma distant organ metastasis in mice. To dissect the underlying molecular mechanisms, we established LEC co-cultures with different melanoma cells originating from primary tumors or metastases. Notably, the expansively growing metastatic melanoma cells adopted an invasively sprouting phenotype in 3D matrix that was dependent on MMP14, Notch3 and beta 1-integrin. Unexpectedly, MMP14 was necessary for LEC-induced Notch3 induction and coincident beta 1-integrin activation. Moreover, MMP14 and Notch3 were required for LEC-mediated metastasis of zebrafish xenografts. This study uncovers a unique mechanism whereby LEC contact promotes melanoma metastasis by inducing a reversible switch from 3D growth to invasively sprouting cell phenotype

Lymphatic endothelial cells as a pro-metastatic component of the melanoma microenvironment

The tumor microenvironment (TME) has a tremendous impact on cancer progression, and studies of cancer communication with the TME can provide new avenues for combinatorial cancer treatments. Tumor associated lymphatic vasculature is well acknowledged for its role in mediating cancer cell dissemination to distant sites. However, lymphatic vasculature does not only act as a passive route for cancer metastasis. For example, although melanoma cell dissemination to the draining lymph nodes is used as a prognostic factor, lymph node removal does not improve the outcome of the patients, suggesting that lymphatic vasculature actively drives melanoma aggressive characteristics already in the primary tumor. The purpose of this thesis was to characterize the active, cancer-promoting crosstalk between melanoma and lymphatic endothelial cells (LECs), the crucial component of the lymphatic vasculature. We found that the melanoma cell-LEC crosstalk changes the biological properties in both cell types. In vitro, melanoma cells originating from the melanoma metastases became more invasive upon LEC co-culture, whereas LECs started sprouting when cultured as spheroids in a 3D fibrin matrix and showed impaired tube formation and barrier function. An in vivo mouse xenograft assay indicated that melanoma cells originating from metastasis formed significantly more metastases to liver and lung when pre-cultured with LECs compared to the melanoma cells from a parental monotypic culture. Mechanistically, we found that the LEC co-culture induced a change in the MMP14 localization in melanoma cells from the cytosol to the plasma membrane, and that MMP14 mediated Notch3 induction and beta 1 integrin activation in melanoma cells. We showed that all three proteins were required for the more invasive phenotype of melanoma cells, and MMP14 and Notch3 were required for the increased metastasis of melanoma cells as shown using a zebrafish embryo xenograft model. We further showed that Notch3 on the melanoma cell surface is activated by the Notch ligand DLL4, a ligand abundantly expressed by LECs, and that the activated Notch3 induces WNT5B transcription in melanoma cells. WNT5B, in turn, contributes to the functional changes that melanoma cells cause in LECs. In a publicly available melanoma patient dataset, high Notch3 expression in melanoma samples was found to correlate with worse prognosis, and Notch3 and WNT5B expression coincided in these samples. When primary and metastasis samples in a cohort of 31 melanoma patients were analyzed by IHC, the co-localization of Notch3 and WNT5B was found to be significantly higher in the metastasis samples if compared to the primary tumor, further supporting that the co-expression of Notch3 and WNT5B is characteristic for the aggressive melanoma type. In a mouse ear xenograft model, WNT5B expression in melanoma cells enhanced their metastasis to the draining lymph nodes. These results provide evidence for the bi-directional, active melanoma cell-LEC communication and represent possible leads to targets of new combinatorial treatment options.Syöpää ympäröivällä kudoksella, niin kutsutulla syövän mikroympäristöllä, on merkittävä vaikutus syövän kehittymiselle ja sairauden etenemiselle, minkä vuoksi syövän mikroympäristön tutkiminen voi avata ovia uusille, tehokkaille yhdistelmähoidoille. Syövän mikroympäristöön kuuluvan imusuoniston tiedetään olevan tärkeä väylä syövän leviämiselle ja etäpesäkkeiden muodostumiselle, mutta imusuonisto ei toimi ainoastaan passiivisena kulkureittinä syöpäsoluille. Esimerkiksi, vaikka melanooman diagnostiikassa syöpäsolujen löytyminen vartijaimusolmukkeista korreloi huonomman ennusteen kanssa, metastaattisten vartijaimusolmukkeiden poisto ei kuitenkaan paranna potilaiden ennustetta. Tämä viittaa siihen, että imusuonisto saa aikaan aggressiivisia muutoksia melanoomasoluissa jo primaarikasvaimessa. Tämän työn tarkoituksena oli tutkia aktiivista, melanooman leviämiseen johtavaa vuorovaikutusta melanoomasolujen ja imusuoniston endoteelisolujen, eli imusuoniston seinämän muodostavien solujen, välillä. Työni osoitti, että melanoomasolujen ja imusuoniston endoteelisolujen vuorovaikutus aiheuttaa molekulaarisia ja toiminnallisia muutoksia molemmissa. Työssäni näytin, että metastaaseista lähtöisin olevat melanoomasolulinjat tulevat invasiivisemmiksi ja metastasoivat herkemmin, kun niitä kasvatetaan yhdessä imusuoniston endoteelisolujen kanssa. Vastavuoroisesti melanoomasolut aiheuttavat muutoksia endoteelisolujen kasvutavassa 3-ulotteisissa soluviljelmissä sekä häiriöitä niiden muodostaman solukerroksen rakenteessa ja integriteetissä. Näiden muutosten seurauksena imusuonistosta voi tulla läpäisevämpi, mikä edesauttaa syöpäsolujen siirtymistä primaarikasvaimesta imusuonistoon ja sieltä kauempana sijaitseviin elimiin. Väitöskirjatyössäni osoitin myös, että imusuoniston endoteelisolut saavat aikaan MMP14:n siirtymisen melanoomasolun sytoplasmasta solun plasmamembraanille, ja että tämä saa aikaan Notch3:n indusoitumisen ja beta 1 integriinin aktivoitumisen melanoomasoluissa. Näytin työssäni, että kaikki kolme proteiinia ovat tärkeitä melanooman lisääntyneelle invaasiolle, ja seeprakalan alkiota hyödyntävässä kokeessa osoitin, että MMP14 ja Notch3 tarvitaan melanooman aggressiivisempaan metastaasiaktiivisuuteen. Notch-ligandi DLL4, jota on runsaasti imusuoniston endoteelisolujen pinnalla, saa aikaan Notch3-reseptorin aktivaation melanoomasolussa. Aktivoitu Notch3 lisäsi WNT5B:n transkriptiota melanoomasoluissa, ja WNT5B puolestaan oli osallisena melanooman aikaansaamiin biologisiin muutoksiin imusuoniston endoteelisoluissa. Julkisesti saatavilla olevan melanoomakohortin analyysi osoitti, että korkea Notch3:n ilmentyminen melanoomakasvaimissa korreloi huonon ennusteen kanssa, ja lisäksi Notch3:n ja WNT5B:n ilmentyminen korreloi keskenään. Näytteet sellaisesta melanoomakohortista, johon oli saatavilla näytteet sekä primaarikasvaimesta että metastaaseista, osoitti, että Notch3 ja WNT5B lokalisoituvat yhdessä erityisesti metastaasinäytteissä, viitaten siihen, että molemmat proteiinit ilmentyvät yhdessä erityisesti aggressiivisissa melanoomasolupopulaatioissa. Lopuksi osoitin, että WNT5B edistää melanooman metastasointia vartijaimusolmukkeisiin hiirimallissa. Työni tulokset selvittivät mekanismeja melanooman ja imusuoniston kaksisuuntaisesta, aktiivisesta vuorovaikutuksesta, ja voivat auttaa löytämään potentiaalisia kohteita uusille melanooman yhdistelmähoidoille