Reparation of an inflamed air-liquid interface cultured a549 cells with nebulized nanocurcumin

The anti-inflammatory, antifibrotic and antimicrobial activities of curcumin (CUR) are missed because of its low solubility in aqueous media, low bioavailability, and structural lability upon oral intake. Soft nanoparticles such as nanoliposomes are not efficient as CUR carriers, since crystalline CUR is expelled from them to physiological media. Nanostructures to efficiently trap and increase the aqueous solubility of CUR are needed to improve both oral or nebulized delivery of CUR. Here we showed that SRA1 targeted nanoarchaeosomes (nATC) [1:0.4 w:w:0.04] archaeolipids, tween 80 and CUR, 155 ± 16 nm sized of −20.7 ± 3.3 z potential, retained 0.22 mg CUR ± 0.09 per 12.9 mg lipids ± 4.0 (~600 µM CUR) in front to dilution, storage, and nebulization. Raman and fluorescence spectra and SAXS patterns were compatible with a mixture of enol and keto CUR tautomers trapped within the depths of nATC bilayer. Between 20 and 5 µg CUR/mL, nATC was endocytosed by THP1 and A549 liquid–liquid monolayers without noticeable cytotoxicity. Five micrograms of CUR/mL nATC nebulized on an inflamed air–liquid interface of A549 cells increased TEER, normalized the permeation of LY, and decreased il6, tnfα, and il8 levels. Overall, these results suggest the modified pharmacodynamics of CUR in nATC is useful for epithelia repair upon inflammatory damage, deserving further deeper exploration, particularly related to its targeting ability.Fil: Altube, María Julia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; ArgentinaFil: Caimi, Lilen Ivonne. Fundación Instituto Leloir; ArgentinaFil: Huck Iriart, Cristián. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de San Martín. Escuela de Ciencia y Tecnología; ArgentinaFil: Morilla, María José. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; ArgentinaFil: Romero, Eder Lilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; Argentin

Fast Biofilm Penetration and Anti-PAO1 Activity of Nebulized Azithromycin in Nanoarchaeosomes

Azithromycin (AZ) is a broad-spectrum antibiotic with anti-inflammatory and antiquorum sensing activity against biofilm forming bacteria such as Pseudomonas aeruginosa. AZ administered by oral or parenteral routes, however, neither efficiently accesses nor remains in therapeutic doses inside pulmonary biofilm depths. Instead, inhaled nanocarriers loaded with AZ may revert the problem of low accessibility and permanence of AZ into biofilms, enhancing its antimicrobial activity. The first inhalable nanovesicle formulation of AZ, nanoarchaeosome-AZ (nanoARC-AZ), is here presented. NanoARC prepared with total polar archaeolipids (TPAs), rich in 2,3-di-O-phytanyl-sn-glycero-1-phospho-(3′-sn-glycerol-1′-methylphosphate) (PGP-Me) from Halorubrum tebenquichense archaebacteria, consisted of ∼180 nm-diameter nanovesicles, loaded with 0.28 w/w AZ/TPA. NanoARC-AZ displayed lower minimal inhibitory concentration and minimal bactericidal concentration, higher preformed biofilm disruptive, and anti-PAO1 activity in biofilms than AZ. NanoARC penetrated and disrupted the structure of the PAO1 biofilm within only 1 h. Two milliliters of 15 μg/mL AZ nanoARC-AZ nebulized for 5 min rendered AZ doses compatible with in vitro antibacterial activity. The strong association between AZ and the nanoARC bilayer, combined with electrostatic attraction and trapping into perpendicular methyl groups of archaeolipids, as determined by Laurdan fluorescence anisotropy, generalized polarization, and small-angle X-ray scattering, was critical to stabilize during storage and endure shear forces of nebulization. NanoARC-AZ was noncytotoxic on A549 cells and human THP-1-derived macrophages, deserving further preclinical exploration as enhancers of AZ anti-PAO1 activity.Fil: Altube, María Julia. Universidad Nacional de Quilmes; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Martínez, Melina María Belén. Universidad Nacional de Quilmes; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Malheiros, Barbara. Universidade de Sao Paulo; BrasilFil: Maffía, Paulo C.. Universidad Nacional de Quilmes; ArgentinaFil: Barbosa, Leandro R. S.. Universidade de Sao Paulo; BrasilFil: Morilla, María José. Universidad Nacional de Quilmes; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Romero, Eder Lilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes; Argentin

Enhanced photodynamic leishmanicidal activity of hydrophobic zinc phthalocyanine within archaeolipids containing liposomes

In this work, the in vitro anti-Leishmania activity of photodynamic liposomes made of soybean phosphatidylcholine, sodium cholate, total polar archaeolipids (TPAs) extracted from the hyperhalophile archaea Halorubrum tebenquichense and the photosensitizer zinc phthalocyanine (ZnPcAL) was compared to that of ultradeformable photodynamic liposomes lacking TPAs (ZnPcUDLs). We found that while ZnPcUDLs and ZnPcALs (130 nm mean diameter and ?35 mV zeta potential) were innocuous against promastigotes, a low concentration (0.01 µM ZnPc and 7.6 µM phospholipids) of ZnPcALs irradiated at a very low-energy density (0.2 J/cm2) eliminated L. braziliensis amastigotes from J774 macrophages, without reducing the viability of the host cells. In such conditions, ZnPcALs were harmless for J774 macrophages, HaCaT keratinocytes, and bone marrow-derived dendritic cells. Therefore, topical photodynamic treatment would not likely affect skin-associated lymphoid tissue. ZnPcALs were extensively captured by macrophages, but ZnPcUDLs were not, leading to 2.5-fold increased intracellular delivery of ZnPc than with ZnPcUDLs. Despite mediating low levels of reactive oxygen species, the higher delivery of ZnPc and the multiple (caveolin- and clathrin-dependent plus phagocytic) intracellular pathway followed by ZnPc would have been the reason for the higher antiamastigote activity of ZnPcALs. The leishmanicidal activity of photodynamic liposomal ZnPc was improved by TPA-containing liposomes.Fil: Perez, Ana Paula. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; ArgentinaFil: Casasco, Agustina. Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires. Hospital General de Niños "Ricardo Gutiérrez". Servicio de Parasitología y Chagas; ArgentinaFil: Schilrreff, Priscila. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Defain Tesoriero, María Victoria. Instituto Nacional de Tecnología Industrial. Centro de Investigación y Desarrollo en Química; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; ArgentinaFil: Duempelmann, Luc. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; ArgentinaFil: Pappalardo, Juan Sebastian. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Virología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Altube, María Julia. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Higa, Leticia Herminia. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Morilla, María José. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Petray, Patricia Beatriz. Gobierno de la Ciudad de Buenos Aires. Hospital General de Niños "Ricardo Gutiérrez". Servicio de Parasitología y Chagas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Romero, Eder Lilia. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

The anti MRSA biofilm activity of Thymus vulgaris essential oil in nanovesicles

Background: Thymus vulgaris essential oil (T) could be an alternative to classical antibiotics against bacterial biofilms, which show increased tolerance to antibiotics and host defence systems and contribute to the persistence of chronic bacterial infections. Hypothesis: A nanovesicular formulation of T may chemically protect the structure and relative composition of its multiple components, potentially improving its antibacterial and antibiofilm activity. Study design: We prepared and structurally characterized T in two types of nanovesicles: nanoliposomes (L80-T) made of Soybean phosphatidylcholine (SPC) and Polysorbate 80 (P80) [SPC:P80:T 1:0.75:0.3 w:w], and nanoarchaeosomes (A80-T) made of SPC, P80 and total polar archaeolipids (TPA) extracted from archaebacteria Halorubrum tebenquichense [SPC:TPA:P80:T 0.5:0.50.75:0.7 w:w]. We determined the macrophage cytotoxicity and the antibacterial activity against Staphylococcus aureus ATCC 25,923 and four MRSA clinical strains. Results: L80-T (Z potential −4.1 ± 0.6 mV, ∼ 115 nm, ∼ 22 mg/ml T) and A80-T (Z potential −6.6 ± 1.5 mV, ∼ 130 nm, ∼ 42 mg/ml T) were colloidally and chemically stable, maintaining size, PDI, Z potential and T concentration for at least 90 days. While MIC 90 of L80-T was > 4 mg/ml T, MIC 90 of A80-T was 2 mg/ml T for all S. aureus strains. The antibiofilm formation activity was maximal for A80-T, while L80-T did not inhibit biofilm formation compared to untreated control. A80-T significantly decreased the biomass of preformed biofilms of S. aureus ATCC 25,923 strain and of 3 of the 4 clinical MRSA isolates at 4 mg/ml T. It was found that the viability of J774A.1 macrophages was decreased significantly upon 24 h incubation with A80-T, L80-T and T emulsion at 0.4 mg/ml T. These results show that from 0.4 mg/ml T, a value lower than MIC 90 and the one displaying antibiofilm activity, with independence of its formulation, T significantly decreased the macrophages viability. Conclusion: Overall, because of its lower MIC 90 against planktonic bacteria, higher antibiofilm formation capacity and stability during storage, A80-T resulted better antibacterial agent than T emulsion and L80-T. These results open new avenues to explode the A80-T antimicrobial intracellular activity.Fil: Perez, Ana Paula. Universidad Nacional de San Martín. Escuela de Ciencia y Tecnología; ArgentinaFil: Perez, Noelia Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de San Martín. Escuela de Ciencia y Tecnología; ArgentinaFil: Suligoy Lozano, Carlos Mauricio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Altube, María Julia. Universidad Nacional de San Martín. Escuela de Ciencia y Tecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: de Farias, Marcelo Alexandre. No especifíca;Fil: Portugal, Rodrigo Villares. No especifíca;Fil: Buzzola, Fernanda Roxana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Medicina. Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica; ArgentinaFil: Morilla, María José. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de San Martín. Escuela de Ciencia y Tecnología; ArgentinaFil: Romero, Eder Lilia. Universidad Nacional de San Martín. Escuela de Ciencia y Tecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Nanovesículas arqueolípidicas para targeting activo de agentes antiinflamatorios y antibioticos a macrófagos

ResumenInicialmente, este trabajo de Tesis doctoral se orientó a aislar y purificar arqueolipidos polares totales (APT) de la membrana celular de la arquebacteria Halorubrum tebenquichense. A tal fin se puso a punto un protocolo, que consistió en el fraccionamiento de la mezcla de APT mediante cromatografía en columna con Silica 60. Esta técnica permitió obtener fracciones enriquecidas en los lípidos manosilados SDGD-5 y SGDG-5PA, y en el fosfolípido PGP-Me. Luego, con cada una de estas fracciones arqueolipidicas se prepararon dos tipos de nanovesiculas: unas enriquecidos en cada una de estas fracciones, otras combinando cada una de dichas fracciones con fosfolípidos de soja. Las nanovesiculas se prepararon por el método de resuspensión de la película lipídica, que luego se homogeneizaron mediante sonicación y extrusión, hasta lograr tamaños promedios entre 100 y 200 nm medidos por dispersión dinámica de la luz. Nuestra hipótesis inicial fue que el enriquecimiento de nanovesiculas en glicoarqueolipidos como SDGD-5 y SGDG-5PA, aumentaría la extensión de su captura celular, y de esta forma podrían usarse como poderosos agentes de delivery intracelular de drogas. Para verificarlo, se determinó la captura de cada uno de estas nanovesiculas, por macrófagos cultivados in vitro. A tal fin, se analizó mediante citometría de flujo la internalización celular por la línea de macrófagos J774A.1, de los diferentes tipos de nanovesiculas marcados con el fluoroforo de membrana RhPE. Sorprendentemente, observamos que los nanovesiculas enriquecidas en glicoarqueolipidos (y carentes de PGP-Me) se capturaron en muy baja extensión, en tanto aquellas enriquecidos en PGP-Me (y carentes de glicoarqueolipidos), o los preparados con arqueolípidos sin fraccionar (APT; nanovesiculas conocidas como arqueosomas [ARQ], conteniendo PGP-Me y glicoarqueolípidos), fueron los más extensamente capturadas. Se concluyo que fue el PGP-Me y no los glicoarqueolipidos los que jugaron un rol clave en la extensión de captura por macrófagos. Para elucidar el mecanismo responsable, se llevó a cabo un ensayo de competición de captura por células J774A.1. A tal fin, ARQ marcados con RhPE se incubaron con células J774A.1, en presencia o ausencia de competidores de captura y su internalización se determinó por citometría de flujo. Como competidores de captura, se utilizaron ligandos conocidos de receptores de membrana, involucrados en mecanismos de captura endocitica, a saber: ácido poli-inosinico (ligando de receptores scavenger clase A), fosfatidilserina (ligando de receptores scavenger clase B), y un polisacárido de manosa (ligando del receptor de manosa). Observamos que la captura se vio inhibida en un 80 ± 20%, únicamente en presencia de ácido poliinosinico. Se concluyó entonces que los ARQ (o nanovesiculas conteniendo APT) fueron los más extensamente endocitados, principalmente mediante receptores scavenger clase A. Por esta razón en esta Tesis empleamos nanovesiculas preparadas en base a APT, ya como arqueosomas (únicamente APT) o combinados con otros lípidos. En segundo lugar, se exploró la citotoxicidad de ARQ sobre macrófagos por distintos métodos, a saber: MTT, LDH y apoptosis/necrosis mediante microscopia de fluorescencia con Ioduro de propidio, Hoeschst y YO-PRO y ensayo del TUNEL. Supimos que hasta un valor de 100 µg/ml los ARQ no afectan la viabilidad celular, ni la estructura de la membrana plasmática, aunque podrían al cabo de 24 h, inducir apoptosis sobre una fracción de esta línea celular. Los detalles experimentales y resultados hasta aquí descriptos se discuten extensamente en el Capítulo 2. En el Capítulo 3, se presentó el diseño de nanovesiculas capaces de aumentar la extensión del delivery citoplásmico respecto del provisto por ARQ o nanovesículas fosfolipidicas ordinarias. Para esto modificamos la estructura de ARQ, tal que fueran capaces de responder a cambios de pH: consideramos que una vez endocitados, la disminución de pH ofrecida por el interior endosomal gatillaría una transición de fase responsable del vuelco de su contenido interno al citoplasma. Partiendo entonces de la matriz pH sensible DOPE:CHEMS 7:3:0 (LpH) a la que se le incorporaron cantidades crecientes de APT, nació el diseño de los llamados arqueosomas pH sensibles. Para evaluar la pH sensibilidad de estas formulaciones frente a la acidez, el par fluoroforo quencher HPTS-DPX fue incorporado a su interior acuoso. Primeramente, se evaluó la pH sensibilidad de los distintos nanovesiculas en ausencia de células. Para ello, se las incubo por 10 minutos a 37°C a distintos pH y luego se midio la intensidad de fluorescencia del HPTS dequencheado, liberado al ocurrir la transición de fase y desestabilización de la membrana nanovesicular. Hallamos que a pH 4,5 la formulación conteniendo DOPE y CHEMS LpHa liberó 50 % de su contenido acuoso. Hallamos además que dicho porcentaje decreció a medida que las formulaciones aumentaban su proporción de APT, hasta ser nulo para los ARQ. Esto significo que los ARQ son completamente pH-insensibles, en tanto que pudieron obtenerse formulaciones pH-sensibles conteniendo una fracción relativamente pequeña de APT. El siguiente paso fue evaluar la capacidad de las distintas formulaciones para ejecutar delivery citoplásmico sobre varias líneas celulares: J774A.1, NR8383 (macrófagos alveolares de rata) y A549 (neumocitos tipo II humanos). Para esto se utilizaron nanovesiculas con doble marca, RhPE y HPTS-DPX. De esta forma se pudo evaluar, por un lado, la cantidad de contenido acuoso liberado al citoplasma por cada nanovesicula, y por otro la extensión de su captura (ya que aquellas formulaciones con baja proporción de APT podían ser menos capturadas). Así determinamos que los nanovesiculas ApH3, formulación pH sensible con mayor proporción de APT, proporcionaron la máxima cantidad de HPTS citoplásmico. El máximo delivery citoplásmico en este caso resulto de la combinación única de una elevada tasa de captura con una relativa pHsensibilidad. Las nanovesiculas ordinarias (no pH sensibles) no son herramientas útiles para entregar drogas hidrosolubles al citoplasma celular: luego de ser endocitadas, su contenido acuoso queda atrapado en el interior endo-lisosomal, resultando inaccesible al citoplasma celular. Por el contrario, una de las importantes prestaciones de nanovesiculas como ApH3, radica en su capacidad para ofrecer delivery masivo de drogas hidrosolubles al citoplasma celular. Tal es el caso de la forma hidrofílica del anti-inflamatorio dexametasona fosfato (DEX-P) cuya acción depende de la unión al receptor de glucocorticoide citoplasmático. DEX-P fue incorporada al interior acuoso de distintos nanovesiculas- incluyendo ApH3- y se evaluó su citotoxicidad sobre las líneas celulares J774A.1, macrófagos THP-1 (macrófagos transformados a partir de monocitos humanos) y A549. Hallamos que ninguna formulación afecto la viabilidad celular hasta concentraciones 10 µg/ml de DEX-P y 50 µg de LT luego de 24 horas de incubación con J774 y THP1, mientras que en células A549 la viabilidad no disminuyó hasta 50 µg/ml DEX-P y 250 µg/ml de LT. En estas mismas líneas celulares se evaluó la actividad anti-inflamatoria de DEX-P incorporada en distintas nanovesiculas - incluyendo ApH3-, luego de co-incubar y pre incubar las células con LPS o PMA y medir la liberación de citoquinas pro-inflamatorias mediante Elisa de captura. Hallamos que ApH3-DEX-P indujo la máxima disminución de liberación de TNF-α e IL-6 por células J774A.1. En células A549, observamos que solo disminuyo significativamente la liberación de IL-6, sin diferencias significativas entre muestras. En células THP-1 finalmente, determinamos que tanto nanovesiculas vacías como conteniendo DEX-P disminuyeron la liberación de TNF-α, IL-1β e IL-6 más pronunciadamente que DEX-P libre. También se testeó la actividad anti-inflamatoria de nanovesiculas-DEX-P midiendo su capacidad para inhibir la generación de especies reactivas de oxigeno (ERO). Para ello se cuantificó la intensidad de fluorescencia generada por la sonda DCFDA, luego de ser incubada durante 24 horas con células J774A.1 o THP-1 activadas con LPS en presencia o ausencia de nanovesiculas, mediante un equipo Cytation 5. DCFDA es una molécula que una vez endocitada se desacetila y en presencia de ERO se oxida a una forma fluorescente. Así, determinamos que ApH3 produjo una disminución de ERO significativamente mayor que con LpH o DEX-P libre. El conjunto de estos resultados permite sugerir que los ApH3 constituyen una herramienta eficaz para aumentar el delivery citoplásmico de DEX-P -y por ende su actividad anti-inflamatoria- en cultivos celulares in vitro. Por otra parte, se evaluó la estabilidad coloidal de los distintas nanovesiculas (con y sin APT) luego de almacenados durante tres y seis meses a 4°C. Hallamos que todas las formulaciones mantuvieron tamaños en el orden de los 200 nm con índices de polidispersidad menores a 0,4. Luego, determinamos su capacidad (fundamentalmente de LpH [formulación ph sensible y carente de arqueolípidos] y de ApH3) para resistir el estrés de nebulización. La técnica de nebulización elegida fue la de malla vibradora, que permite formar microgotas de tamaño de 2 a 4 micrones, facilitando su acceso a los alveolos donde los macrófagos allí residentes juegan un rol clave en el establecimiento de procesos inflamatorios pulmonares. Se determinaron así los cambios en tamaño, concentración de lípidos y liberación de HPTS antes y después de la nebulización de las suspensiones nanovesiculares, luego de recolectarlas en un balón conectado al nebulizador. Hallamos que tras nebulizadas, ApH3 y LpH mantuvieron sus tamaños. Sin embargo, mientras que de las nanovesiculas ApH3 nebulizadas se recuperó el 70% del HPTS encapsulado, para LpH solo se recuperó el 50%. Esta diferencia es aún mayor al nebulizar nanovesiculas almacenados durante seis meses; mientras que ApH3 mantuvo su performance, la cantidad de nanovesiculas LpH nebulizadas estuvo por debajo del límite de detección. La determinación de su performance como agente de delivery citoplásmico de drogas antiinflamatorios estructuralmente resistente al estrés de nebulización, fue complementada con el estudio de su interacción con el surfactante pulmonar (SP). El SP recubre el epitelio alveolar y debe ser atravesado por toda nanovesicula nebulizada antes de contactar las células (macrófagos o células epiteliales alveolares) subyacentes. A tal fin se trabajó en conjunto con el grupo de Biofísica del CIBAAL de la Universidad de Santiago del Estero. En el Capítulo 4 se describe la preparación de monocapas de SP en balanza de Langmuir. Se determinó a continuación si ARQ, L, LpH y ApH inyectados o nebulizados a la interfase acuosa en distintas condiciones de compresión, perturbaban la presión superficial de SP a lo largo de ciclos dinámicos de compresión-expansión del SP, en un intento de simular la dinámica respiratoria. Hallamos que las formulaciones ApH3 no solo no indujeron inactivación de surfactante, sino que hasta conseguían mejorar su función reductora de tensión superficial. Además, observamos que nebulizados sobre células cubiertas con SP, su extensión captura y subsiguiente capacidad de delivery citoplásmico se mantenían prácticamente intactas. En el Capítulo 5, la actividad de nanovesiculas preparadas en base a APT como agentes antiinflamatorios nebulizables, derivo en otra potencial aplicación terapéutica: su uso como agente antimicrobiano. En este caso, buscamos aumentar el delivery al sistema endo-lisosomal (sitio donde residen ciertos agentes infecciosos pulmonares), y en paralelo, aumentar el acceso a biofilms formados por bacterias que colonizan las vías respiratorias superiores. Así, el antibiótico ácido lábil azitromicina (AZ) fue incorporado en la formulaciones nanovesiculares no pH sensibles ARQ y L. Se determino su citotoxicidad sobre células THP-1 convertidas a macrófagos y sobre células A549. Observamos que la estabilidad de las nanovesiculas ARQ-AZ frente a nebulización fue muy superior a las del resto. Medimos la actividad antibacteriana de las distintas formulaciones sobre biofilms de Staphylococcus aureus. Los resultados preliminares mostraron que AZ mantuvo su efecto antimicrobiano aun incorporada en las nanovesiculas.En el Capítulo 6 por último, una única aplicación ajena a nebulización de las nanovesiculas preparadas en base a APT, busco explotar la combinación de su elevado potencial Z negativo con su naturaleza estructural responsable de alta estabilidad frente al almacenamiento. Dada su capacidad de disminuir la actividad de la enzima fosfolipasa A2 (PLA2), hipotetizamos aquí que los ARQ tendrían un rol como agentes antivenenos, complementario al uso de sueros antiofídicos. La PLA2 es un componente enzimático de venenos de Bothrops responsable de generar intermediarios de inflamación, dolor, hemolisis y mionecrosis. Se llevaron a cabo ensayos preliminares de inhibición de actividad de venenos de yarará sobre cultivos celulares de fibroblastos (L20B) y células musculares (RD), células target de los venenos, en donde se demostró que ARQ de tamaños > 200 nm a una concentración de 50 mg/mL lograron inhibir la actividad citotóxica del veneno de la serpiente Bothrops neuwidi diporus.Fil: Altube, María Julia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Centro de Investigación y Desarrollo en Nanomedicinas; Argentin

Nanostructures as robust multimodal anti-Bothrops snake envenoming agents

Snake envenoming is a partly solved threat that constitutes a major concern for the public health of tropical and subtropical countries. Antisera based in polyclonal heterologous antibodies save the victims’ life, but often are not efficient enough to avoid the amputation of the affected limbs. In this strategic approach we propose to complement the site-specific activity of the antisera by co administering special nanovesicles capable of adsorbing and thereby reducing the enzymatic activities responsible for neurotoxicity, pain, haemolysis, and fundamentally severe inflammation and myonecrosis, that end up in limbs ‘amputation.Fil: Altube, María Julia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; ArgentinaFil: Morilla, María José. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; ArgentinaFil: Romero, Eder Lilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; Argentin

Photodynamic Therapy with Nebulized Nanocurcumin on A549 Cells, Model Vessels, Macrophages and Beyond

This study aimed to determine the damage mechanisms caused by naturally targeted nanoarchaeosomes made of diether lipids from Halorubrum tebenquichense loaded with curcumin (CUR, nATC), which mediated photodynamic therapy (PDT) on A549 cells and on THP-1-macrophages, two cell types found in airway cancers. The effect of nATC- PDT on vessels modeled with a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM), after dropping the formulations on its surface covered with mucins, was also determined. nATCs are known to efficiently trap CUR for at least six months, constituting easy-to-prepare, stable formulations suitable for nebulization. CUR instead, is easily released from carriers such as liposomes made of ordinary phospholipids and cholesterol after a few weeks. Irradiated at 9 J/cm2, nATC (made of archaeolipids: Tween 80: CUR at 1:0.4:0.04 w:w, size 180 ± 40 nm, ζ potential −24 mV, 150 μg CUR/15 mg lipids/mL) was phototoxic (3.7 ± 0.5 μM IC50), on A549 cells after 24 h. The irradiation reduced mitochondrial membrane potential (ΔΨm), ATP levels and lysosomal functionalism, and caused early apoptotic death and late necrosis of A549 cells upon 24 h. nATC induced higher extra and intracellular reactive oxygen species (ROS) than free CUR. nATC-PDT impaired the migration of A549 cells in a wound healing assay, reduced the expression of CD204 in THP-1 macrophages, and induced the highest levels of IL-6 and IL-8, suggesting a switch of macrophage phenotype from pro-tumoral M2 to antitumoral M1. Moreover, nATC reduced the matrix metalloproteinases (MMP), −2 and −9 secretion, by A549 cells with independence of irradiation. Finally, remarkably, upon irradiation at 9 J/cm2 on the superficial vasculature of a CAM covered with mucins, nATC caused the vessels to collapse after 8 h, with no harm on non-irradiated zones. Overall, these results suggest that nebulized nATC blue light-mediated PDT may be selectively deleterious on superficial tumors submerged under a thick mucin layer

Inhaled lipid nanocarriers for pulmonary delivery of glucocorticoids: Previous strategies, recent advances and key factors description

In view of the strong anti-inflammatory activity of glucocorticoids (GC) they are used in the treatment of almost all inflammatory lung diseases. In particular, inhaled GC (IGC) allow high drug concentrations to be deposited in the lung and may reduce the incidence of adverse effects associated with systemic administration. However, rapid absorption through the highly absorbent surface of the lung epithelium may limit the success of localized therapy. Therefore, inhalation of GC incorporated into nanocarriers is a possible approach to overcome this drawback. In particular, lipid nanocarriers, which showed high pulmonary biocompatibility and are well known in the pharmaceutical industry, have the best prospects for pulmonary delivery of GC by inhalation. This review provides an overview of the pre-clinical applications of inhaled GC-lipid nanocarriers based on several key factors that will determine the efficiency of local pulmonary GC delivery: 1) stability to nebulization, 2) deposition profile in the lungs, 3) mucociliary clearance, 4) selective accumulation in target cells, 5) residence time in the lung and systemic absorption and 6) biocompatibility. Finally, novel preclinical pulmonary models for inflammatory lung diseases are also discussed.Fil: Altube, María Julia. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Perez, Noelia Soledad. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Romero, Eder Lilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; ArgentinaFil: Morilla, María José. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Higa, Leticia Herminia. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Perez, Ana Paula. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentin

Nebulizing novel multifunctional nanovesicles: The impact of macrophage-targeted-pH-sensitive archaeosomes on a pulmonary surfactant

In this study, a NE-U22 vibrating mesh Omron nebulizer was used to deliver the Lissamine™ rhodamine B 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine triethylammonium salt (Rh-PE) and 8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt (HPTS)/p-xylene-bis-pyridinium bromide (DPX) double-labelled macrophage-targeted pH-sensitive archaeosomes (ApH, 174 ± 48 nm, -30 ± 13 mV unilamellar nanovesicles made of dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine: [total polar archaeolipids from the hyperhalophile archaebacteria Halorubrum tebenquichense]: cholesteryl hemisuccinate 4.2:2.8:3 w:w:w) to J774A.1 cells covered by a Prosurf pulmonary surfactant (PS) monolayer at or below the equilibrium surface pressure πe. The uptake and cytoplasmic drug release from ApH were assessed by flow cytometry of Rh-PE and HPTS fluorescence, respectively. Despite being soft matter, nanovesicles are submitted to the dismantling interactions of shear stress of nebulization and contact with the surfactant barrier, and at least a fraction of nebulized ApH was found to be stable enough to execute higher cytoplasmic delivery than archaeolipid-lacking vesicles. Nebulized ApH increased the PS tensioactivity to just below πe, which was beyond the physiological range; this finding indicated that changes in lung surfactant function induced by nebulized nanovesicles were less likely to occur in vivo. The cytoplasmic delivery from ApH slightly decreased across monolayers at πe; this suggested that nanovesicles crossed the PS in a fashion inversely related to monolayer compression. Laurdan generalized polarization and fluorescence anisotropy were used to reveal that nanovesicles neither depleted B and C proteins of the PS nor increased the fluidity of the PS. Together with the feasibility of the cytoplasmic drug delivery upon nebulization, our results suggest that ApH are structurally unique nanovesicles that would not induce biophysical changes leading to PS inactivation and open the door to deeper future translational studies.Fil: Altube, María Julia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; ArgentinaFil: Cutró, Andrea Carmen. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones y Transferencia de Santiago del Estero. Universidad Nacional de Santiago del Estero. Centro de Investigaciones y Transferencia de Santiago del Estero; ArgentinaFil: Bakas, Laura Susana. Universidad Nacional de La Plata. Facultad de Ciencias Exactas; ArgentinaFil: Morilla, María José. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; ArgentinaFil: Disalvo, Edgardo Anibal. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones y Transferencia de Santiago del Estero. Universidad Nacional de Santiago del Estero. Centro de Investigaciones y Transferencia de Santiago del Estero; ArgentinaFil: Romero, Eder Lilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología. Laboratorio de Diseño de Estrategias de Targeting de Drogas; Argentin

Surviving nebulization-induced stress: dexamethasone in pH-sensitive archaeosomes

Aim: To increase the subcellular delivery of dexamethasone phosphate (DP) and stability to nebulization stress, pH-sensitive nanoliposomes (LpH) exhibiting archaeolipids, acting as ligands for scavenger receptors (pH-sensitive archaeosomes [ApH]), were prepared. Materials & methods: The anti-inflammatory effect of 0.18 mg DP/mg total lipid, 100–150 nm DP-containing ApH (dioleylphosphatidylethanolamine: Halorubrum tebenquichense total polar archaeolipids:cholesteryl hemisuccinate 4.2:2.8:3 w:w) was tested on different cell lines. Size and HPTS retention of ApH and conventional LpH (dioleylphosphatidylethanolamine:cholesteryl hemisuccinate 7:3 w:w) before and after nebulization were determined. Results & conclusion: DP-ApH suppressed IL-6 and TNF-α on phagocytic cells. Nebulized after 6-month storage, LpH increased size and completely lost its HPTS while ApH3 conserved size and polydispersity, fully retaining its original HPTS content.Fil: Altube, María Julia. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; ArgentinaFil: Selzer, Solange Mailen. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología; ArgentinaFil: de Farias, Marcelo Alexandre. Brazilian Nanotechnology National Laboratory; BrasilFil: Portugal, Rodrigo Villares. Brazilian Nanotechnology National Laboratory; BrasilFil: Morilla, María José. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología; ArgentinaFil: Romero, Eder Lilia. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología; Argentina. Universidad Nacional de Quilmes. Departamento de Ciencia y Tecnología; Argentin