Caracterização da proteína TcALPH1 e sua possível relação com TcXRNA em Trypanosoma cruzi

Orientador: Dr. Bruno Dallagiovanna MunizCoorientadora: Dra. Fabíola Barbieri HoletzDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 27/09/2021Inclui referências: p. 98-107Resumo: Os tripanosomatídeos apresentam particularidades biológicas, como a ausência de promotores canônicos para a RNA polimerase II e a transcrição policistrônica dos genes, sugerindo que a regulação da expressão gênica ocorra majoritariamente pelo controle de eventos pós-transcricionais. Dentre estes eventos, o controle da degradação e do acesso dos RNA mensageiros (RNAm) à maquinaria de tradução estão diretamente relacionados à adaptação destes parasitas durante o ciclo de vida. Em eucariotos, a degradação dos RNAm é iniciada pela remoção da cauda poliA seguida pela degradação do RNAm tanto no sentido 3'- 5', assim como no sentido 5'- 3'. A via de decaimento no sentido 5' -3' é iniciada pela remoção do cap do RNAm promovida por uma proteína de decapping, seguida da degradação exonucleotídica no sentido 5'-3' pela exonuclease Xrn1. Em T. brucei, a proteína TbALPH1, co-localiza com TbXRNA em grânulos de estresse celular, e exclusivamente, em um grânulo específico no polo posterior da célula. Portanto, este trabalho de dissertação de mestrado tem como objetivo identificar e caracterizar a proteína TcALPH1 e sua possível relação com TcXRNA em T. cruzi. Para investigar a localização dessas proteínas, e seus possíveis parceiros funcionais, foram realizados ensaios de imunoprecipitação e imunofluorescência em formas epimastigotas de T. cruzi, sob condições normais e sob estresse nutricional. Como resultados, foi verificado que TcALPH1 e TcXRNA co-imunoprecipitaram em condições normais de cultivo, e em uma menor abundância sob condições de estresse celular. Esse resultado pode ser um indício de que estas proteínas compartilham de um mesmo complexo proteico. Além disso, outras proteínas envolvidas no metabolismo de RNAm, algumas das quais são marcadoras de P-bodies e grânulos de estresse, também co-imunoprecipitaram com TcALPH1 e TcXRNA. Dentre essas proteínas, vale destacar a C4B63_46g53, uma proteína que contém um domínio com 95.7% de confidência com o domínio WD40 da proteína Ge-1 de eucariotos. Ge-1 é responsável pelo recrutamento de Dcp1/Dcp2 até os P-bodies em células eucarioticas, que até então, não havia sido identificada em tripanosomatídeos. As localizações subcelulares de TcALPH1-GFP e TcXRNA-GFP em parasitas transfectantes, apresentaram um perfil difuso citoplasmático em condições normais. Já sob estresse nutricional, estas proteínas adotaram um perfil granular, embora o controle TcGFP-FLAG tenha apresentado um perfil similar. Também foram realizados ensaios de bloqueio da expressão de TcALPH1 e TcXRNA por CRISPR-Cas 9, objetivando identificar possíveis fenótipos relacionados a ausência da expressão destes genes. Entretanto, foram obtidos somente possíveis clones heminocautes para ambos os genes. Como perspectivas, será realizado um sequenciamento dos RNAs associados aos complexos imunoprecipitados, assim como uma avaliação da localização de TcALPH1 e TcXRNA em diferentes estágios de vida do T. cruzi, além da repetição do ensaio de estresse nutricional e de pH em epimastigotas, utilizando anticorpos policlonais específicos contra estas proteínas. Os clones heminocautes para os genes TcALPH1 e TcXRNA serão sequenciados, e passarão por novas tentativas de bloqueio da expressão, para possíveis avaliações de fenótipos associados a ausência da expressão destes genes.Abstract: Trypanosomatids present biological particularities, such as the absence of canonical promoters for RNA polymerase II and polycistronic transcription of genes, suggesting that the regulation of gene expression occurs mostly by the control of posttranscriptional events. Among these events, the control of degradation and access of messenger RNA (mRNA) to the translation machinery are directly related to the adaptation of these parasites during their life cycle. In eukaryotes, mRNA degradation is initiated by the removal of the polyA tail followed by mRNA degradation in both the 3'-5' and 5'-3' directions. The decay pathway in the 5-'3' direction is initiated by the removal of the mRNA cap promoted by a decapping protein, followed by exonucleotide degradation in the 5'-3' direction by the exonuclease Xrn1. The TbALPH1 protein, colocalizes with TbXRNA in cellular stress granules, and exclusively, in a specific granule at the posterior pole of the cell. Therefore, this work aims to identify and characterize the TcALPH1 protein and its possible interaction with TcXRNA. To investigate the localization of these proteins, and their possible functional partners, immunoprecipitation and immunofluorescence assays were performed on T. cruzi epimastigotes under normal conditions and under nutritional and pH stress. As results, TcALPH1 and TcXRNA were found to co-immunoprecipitate under normal culture conditions, and in a lower abundance under cellular stress conditions. This result may be an indication that these proteins share the same protein complex. In addition, other proteins involved in mRNA metabolism, some of which are markers of P-bodies and stress granules, also co-immunoprecipitated with TcALPH1 and TcXRNA. Among these proteins, it is worth noting C4B63_46g53, a protein that contains a domain with 95.7% confidences with the WD40 domain of the Ge-1 protein of eukaryotes. Ge-1 is responsible for the recruitment of Dcp1/Dcp2 to P-bodies in eukaryotic cells, which until now, had not been identified in trypanosomatids. The subcellular localization of TcALPH1-GFP and TcXRNA-GFP in transfecting parasites showed a diffuse cytoplasmic profile under normal conditions, with a higher concentration around the nucleus. On the other hand, under nutritional stress, these proteins adopted a granular profile, although the TcGFP-FLAG control showed a similar profile. TcALPH1 and TcXRNA were also blocked by CRISPR-Cas 9, aiming to identify possible phenotypes related to the absence of expression of these genes. However, only possible hemi knockout clones for both genes were obtained. The sequencing of the RNAs associated with the immunoprecipitated complexes will be performed, as well as an evaluation of the localization of TcALPH1 and TcXRNA in different life stages of T. cruzi, and the repetition of the nutritional and pH stress assay in epimastigotes, using specific polyclonal antibodies against these proteins. The possible hemi knockoutclones for TcALPH1 and TcXRNA genes will be sequenced, and will undergo new attempts to block expression, from which possible phenotypes associated with the absence of expression of these genes will be evaluated

Caracterização da proteína TcALPH1 e sua possível relação com TcXRNA em Trypanosoma cruzi

Orientador: Dr. Bruno Dallagiovanna MunizCoorientadora: Dra. Fabíola Barbieri HoletzDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa : Curitiba, 27/09/2021Inclui referências: p. 98-107Resumo: Os tripanosomatídeos apresentam particularidades biológicas, como a ausência de promotores canônicos para a RNA polimerase II e a transcrição policistrônica dos genes, sugerindo que a regulação da expressão gênica ocorra majoritariamente pelo controle de eventos pós-transcricionais. Dentre estes eventos, o controle da degradação e do acesso dos RNA mensageiros (RNAm) à maquinaria de tradução estão diretamente relacionados à adaptação destes parasitas durante o ciclo de vida. Em eucariotos, a degradação dos RNAm é iniciada pela remoção da cauda poliA seguida pela degradação do RNAm tanto no sentido 3'- 5', assim como no sentido 5'- 3'. A via de decaimento no sentido 5' -3' é iniciada pela remoção do cap do RNAm promovida por uma proteína de decapping, seguida da degradação exonucleotídica no sentido 5'-3' pela exonuclease Xrn1. Em T. brucei, a proteína TbALPH1, co-localiza com TbXRNA em grânulos de estresse celular, e exclusivamente, em um grânulo específico no polo posterior da célula. Portanto, este trabalho de dissertação de mestrado tem como objetivo identificar e caracterizar a proteína TcALPH1 e sua possível relação com TcXRNA em T. cruzi. Para investigar a localização dessas proteínas, e seus possíveis parceiros funcionais, foram realizados ensaios de imunoprecipitação e imunofluorescência em formas epimastigotas de T. cruzi, sob condições normais e sob estresse nutricional. Como resultados, foi verificado que TcALPH1 e TcXRNA co-imunoprecipitaram em condições normais de cultivo, e em uma menor abundância sob condições de estresse celular. Esse resultado pode ser um indício de que estas proteínas compartilham de um mesmo complexo proteico. Além disso, outras proteínas envolvidas no metabolismo de RNAm, algumas das quais são marcadoras de P-bodies e grânulos de estresse, também co-imunoprecipitaram com TcALPH1 e TcXRNA. Dentre essas proteínas, vale destacar a C4B63_46g53, uma proteína que contém um domínio com 95.7% de confidência com o domínio WD40 da proteína Ge-1 de eucariotos. Ge-1 é responsável pelo recrutamento de Dcp1/Dcp2 até os P-bodies em células eucarioticas, que até então, não havia sido identificada em tripanosomatídeos. As localizações subcelulares de TcALPH1-GFP e TcXRNA-GFP em parasitas transfectantes, apresentaram um perfil difuso citoplasmático em condições normais. Já sob estresse nutricional, estas proteínas adotaram um perfil granular, embora o controle TcGFP-FLAG tenha apresentado um perfil similar. Também foram realizados ensaios de bloqueio da expressão de TcALPH1 e TcXRNA por CRISPR-Cas 9, objetivando identificar possíveis fenótipos relacionados a ausência da expressão destes genes. Entretanto, foram obtidos somente possíveis clones heminocautes para ambos os genes. Como perspectivas, será realizado um sequenciamento dos RNAs associados aos complexos imunoprecipitados, assim como uma avaliação da localização de TcALPH1 e TcXRNA em diferentes estágios de vida do T. cruzi, além da repetição do ensaio de estresse nutricional e de pH em epimastigotas, utilizando anticorpos policlonais específicos contra estas proteínas. Os clones heminocautes para os genes TcALPH1 e TcXRNA serão sequenciados, e passarão por novas tentativas de bloqueio da expressão, para possíveis avaliações de fenótipos associados a ausência da expressão destes genes.Abstract: Trypanosomatids present biological particularities, such as the absence of canonical promoters for RNA polymerase II and polycistronic transcription of genes, suggesting that the regulation of gene expression occurs mostly by the control of posttranscriptional events. Among these events, the control of degradation and access of messenger RNA (mRNA) to the translation machinery are directly related to the adaptation of these parasites during their life cycle. In eukaryotes, mRNA degradation is initiated by the removal of the polyA tail followed by mRNA degradation in both the 3'-5' and 5'-3' directions. The decay pathway in the 5-'3' direction is initiated by the removal of the mRNA cap promoted by a decapping protein, followed by exonucleotide degradation in the 5'-3' direction by the exonuclease Xrn1. The TbALPH1 protein, colocalizes with TbXRNA in cellular stress granules, and exclusively, in a specific granule at the posterior pole of the cell. Therefore, this work aims to identify and characterize the TcALPH1 protein and its possible interaction with TcXRNA. To investigate the localization of these proteins, and their possible functional partners, immunoprecipitation and immunofluorescence assays were performed on T. cruzi epimastigotes under normal conditions and under nutritional and pH stress. As results, TcALPH1 and TcXRNA were found to co-immunoprecipitate under normal culture conditions, and in a lower abundance under cellular stress conditions. This result may be an indication that these proteins share the same protein complex. In addition, other proteins involved in mRNA metabolism, some of which are markers of P-bodies and stress granules, also co-immunoprecipitated with TcALPH1 and TcXRNA. Among these proteins, it is worth noting C4B63_46g53, a protein that contains a domain with 95.7% confidences with the WD40 domain of the Ge-1 protein of eukaryotes. Ge-1 is responsible for the recruitment of Dcp1/Dcp2 to P-bodies in eukaryotic cells, which until now, had not been identified in trypanosomatids. The subcellular localization of TcALPH1-GFP and TcXRNA-GFP in transfecting parasites showed a diffuse cytoplasmic profile under normal conditions, with a higher concentration around the nucleus. On the other hand, under nutritional stress, these proteins adopted a granular profile, although the TcGFP-FLAG control showed a similar profile. TcALPH1 and TcXRNA were also blocked by CRISPR-Cas 9, aiming to identify possible phenotypes related to the absence of expression of these genes. However, only possible hemi knockout clones for both genes were obtained. The sequencing of the RNAs associated with the immunoprecipitated complexes will be performed, as well as an evaluation of the localization of TcALPH1 and TcXRNA in different life stages of T. cruzi, and the repetition of the nutritional and pH stress assay in epimastigotes, using specific polyclonal antibodies against these proteins. The possible hemi knockoutclones for TcALPH1 and TcXRNA genes will be sequenced, and will undergo new attempts to block expression, from which possible phenotypes associated with the absence of expression of these genes will be evaluated

A unique mRNA decapping complex in trypanosomes.

Acknowledgements: We are grateful to the FingerPrints proteomics facility at the University of Dundee and the OMICS Proteomics BIOCEV core facility for excellent technical service. We also thank the Mass Spectrometry facility P02-004 at Fiocruz-Carlos Chagas Institute and the Core Facility for Crystallography and Biophysics (University of Warsaw) for valuable support. We thank Andrea Reichert for her work on the phenotypic analysis of ALPH1ΔN/– cells, Nico Ankenbrand for technical assistance and Tim Krüger for help with imaging (all University of Würzburg).Funder: CAPES; doi: https://doi.org/10.13039/501100002322Funder: Foundation for Polish Science; doi: https://doi.org/10.13039/501100001870Funder: Fiocruz Technological Platform programFunder: University library WürzburgRemoval of the mRNA 5' cap primes transcripts for degradation and is central for regulating gene expression in eukaryotes. The canonical decapping enzyme Dcp2 is stringently controlled by assembly into a dynamic multi-protein complex together with the 5'-3'exoribonuclease Xrn1. Kinetoplastida lack Dcp2 orthologues but instead rely on the ApaH-like phosphatase ALPH1 for decapping. ALPH1 is composed of a catalytic domain flanked by C- and N-terminal extensions. We show that T. brucei ALPH1 is dimeric in vitro and functions within a complex composed of the trypanosome Xrn1 ortholog XRNA and four proteins unique to Kinetoplastida, including two RNA-binding proteins and a CMGC-family protein kinase. All ALPH1-associated proteins share a unique and dynamic localization to a structure at the posterior pole of the cell, anterior to the microtubule plus ends. XRNA affinity capture in T. cruzi recapitulates this interaction network. The ALPH1 N-terminus is not required for viability in culture, but essential for posterior pole localization. The C-terminus, in contrast, is required for localization to all RNA granule types, as well as for dimerization and interactions with XRNA and the CMGC kinase, suggesting possible regulatory mechanisms. Most significantly, the trypanosome decapping complex has a unique composition, differentiating the process from opisthokonts