Investigação da relação entre as células tregulatórias e expressão do gene irf-1 com a patogênese e fenômenos autoimunes nas sindromes mielodisplásicas: avaliação prospectiva e sequencial

BACKGROUND: The myelodysplastic syndromes (MDS) are characterized by clonal proliferation of bone marrow cells with inefficient production of one or more cell lines and consequent peripheral cytopenia and hematopoietic dysplasia. The precise pathogenesis of MDS is still unknown. The good response to antithymocyte globulin therapy corroborates with the hypothesis that MDS might be immunomediated. Autoimmune phenomena have been reported in about 10% of patients with MDS. Although the pathological basis for the occurrence of autoimmune diseases in patients with MDS is not completely understood, several studies have shown abnormal immune function in MDS. Thus, there is current interest in evaluations of aspects related to the immune system that may be related to the pathogenesis of MDS, especially regulatory T cells and a gene Factor Interferon Regulatory (IRF-1).OBJECTIVES: To evaluate the expression of parameters that may be involved in changing the environment in Myelodysplastic bone marrow, such as IRF-1 expression and its relationship with autoimmune changes chronologically (time zero and 1 year) in a prospective study of patients diagnosed with Myelodysplastic Syndrome and correlate these parameters with clinical features and prognosis.MATERIALS AND METHODS: Samples will be collected from peripheral blood of 38 MDS patients, controls and AID to be evaluated on the number and function of regulatory T cells by flow cytometry, cellular culture and the quantification of cytokines related to regulatory T cell function. Expression of IRF-1 gene (INF regulatory factor) and Foxp3 will be performed by RT-PCR in peripheral blood and by immunohistochemistry on bone marrow biopsy. RESULTS: MDS patients showed no difference regarding the Treg number in subgroups determined according to prognosis score: WPSS (p=0,29), IPSS (p=0,5) and IPSS-R (p=0,6). Hemoglobin serum levels was lower in high risk compared to low risk patients (p=0.025), according to IPSS score. There was no difference in Treg number according to the presence of altered karyotype (p=0.12). However, the presence of altered karyotype was more frequent in high risk compared to low risk patients (p=0.017).Treg peripheral number was significantly higher in MDS than in HC (p=0.007) and AID (p=0.008). Peripheral Teff percentage was similar in HC, MDS (p=0,27) and AID (p=0,98). Suppression of proliferation Teff cell mediated by Treg cell was increase in HC group (p=0,003) compared to the AID and SMD group (p=0,434) and MDS (p=0368). Cytokine production of IL10, TNF? and INF? in culture supernatant was decreased in MDS compared to HC and AID. The gene expression of IRF-1 exon 2 (p<0.02) and 4/5 (p<0.01) in total peripheral blood were lower in MDS patients compared to IAD. Additionally, gene expression of IRF-1 exon 4/5 in Treg cell was increased in AID (p=0,005) compared to MDS and HC (p=0,003). Gene expression of Foxp3 in Treg cell was similar in the three groups (p=0,96). MDS patients presented lower CH100 than IAD (p=0,014). The frequency of ANA-positive individuals was higher in MDS than in HC (p=0.029). In the progression of disease the Treg number (p=0.3) and Teff percentage (p=0.06) did not differ after 12 months, albeit there was a trend toward a decrease of Teff. Cultures of Treg:Teff 1:1 showed an increased Teff proliferation in T12 compared to T0 (p=0.02). The cytokine production was significantly increased in culture supernatant (pg/mL) after 12 months. Relative genetic expression of IRF-1 exon 4/5 was increased in whole blood (p=0,001) and Treg (p<0.001) after 12 months. However, genetic expression of exon 2 was only increased in whole blood (p<0.001), while the genetic expression of Foxp3 in Treg did not present statistical differences (p=0.57). Interestingly, a moderate positive correlation between the genetic expression of Foxp3 and IRF-1 exon 4/5 (R=0,659; p=0.002). DISCUSSION: Our results showed that suppression of Teff cell by Treg cell is decrease in MDS, however the peripheral number of Treg cell is higher than in HC and AID, suggesting that the overall regulatory function might be increased in MDS patients. One can hypothesize that it occurs secondarily, in an attempt of controlling the disease immune hyper activation. Interestingly, cytokine production was globally impaired in MDS, revealing a possible exhaustion of immune system, emphasized by complement consumption. In the progression of MDS the increase of Teff proliferation and cytokine production suggests an impairment of Treg suppression ability and might be related to dysfunctions in inhibition by contact and inhibitory cytokine production. The initial reduced expression of IRF-1 in MDS patients evolved with an important increase during the disease progression. The IRF-1 is a powerful tumor gene suppressor and its low expression may be associated to disease progression. Moreover, IRF-1 is involved in several immune functions and high expression was described in MDS patients with autoimmune manifestations, thus the observed higher expression of IRF-1 might be associated to immune alterations, such as the increased cytokine production, like IFN. In mice, IRF-1 inhibits Foxp3 expression in Treg cells. However, our results showed a positive correlation of IRF-1 exon 4/5 and Foxp3. Thus it is possible that the high IRF-1 expression was disproportionally induced by Foxp3 in MDS patients along disease progression.Introdução: As síndromes mielodisplásicas (SMD) são caracterizadas pela proliferação clonal das células da medula óssea (MO), com produção ineficaz de linhagens celulares e conseqüente citopenia periférica. A patogênese precisa das SMD é ainda desconhecida. A boa resposta a terapia com globulina antitimocítica corrobora a hipótese de que sejam doenças imunomediadas e têm sido relatados que cerca de 10% desses pacientes apresentam fenômenos autoimunes. Estudos têm mostrado presença de funções imunológicas anormais e inibidores mediados por células T na hematopoese. Diante disso, há interesse em avaliar parâmetros imunes que possam relacionar-se à SMD como as células Tregulatórias e o gene Fator Regulador de Interferon (IRF-1). Objetivos: Avaliar parâmetros que possam estar implicados no funcionamento do sistema imunitário em pacientes com SMD, tais como, células Tregulatórias (Treg) e expressão do IRF-1 e FoxP3, e sua relação com caraterísticas autoimunes, de forma sequencial (tempo zero e 12 meses), em um estudo prospectivo em pacientes SMD comparados com controles negativos e controles positivos (com doenças autoimunes). MATERIAIS E Métodos: foram coletadas amostras de sangue periférico (SP) e de MO de 38 pacientes com SMD. Como controles negativos, forma colhidos SP de 28 indivíduos saudáveis e como controles positivos, 17 pacientes com doenças autoimunes (DAI=Lupus e Artrite Reumatóide). Nessas amostras foram analisados: o número das células Treg identificados por citometria de fluxo, a função de supressão que as células Treg exercem na proliferação das células Tefetoras (Tefet) em cultura celular em diferentes proporções (Tefet isolada, Teft:Treg:1:1 e Tefet:Treg:8:1). Além disso, no sobrenadante dessas culturas, foi realizada a dosagem de citocinas (IL2, IL4, IL6, IL10, TNF?, INF-?, IL17) por método de CBA. A expressão do gene IRF-1(éxon 2 e 4/5) e FOXP3 por RT-PCR foi identificada em SP e células Treg. No soro dessas amostras, dosou-se, adicionalmente, os autoanticorpos e complemento total. Resultados: Os pacientes com SMD apresentaram a média de idade de 71,7anos (23?93a) e de hemoglobina de 9,6g/dL (5,3-14,9g/dL). Desses 39.5% apresentaram cariótipo alterado e pela a classificação da OMS (2008), 17 pacientes eram CRDM, 3 AR, 10 ARSA, 3 AREB-I, 4 AREB-II e 1 paciente, sindrome 5q-. Classificando os pacientes pelo escore prognóstico IPSS, WPSS e IPSS-R e comparando com o nível de hemoglobina sérica, esta foi menor no grupo de alto risco comparado ao de baixo risco (p=0,025) e quanto ao número de células Treg, não houve diferença: WPSS (p=0,29), IPSS (p=0,5) e IPSS-R (p=0,6), assim como, na presença de cariótipo alterado (p=0,12), também não houve diferença. 27 Comparando os grupos de estudo, o número de Treg (x105cells) foi maior nos pacientes com SMD do que nos controles negativos (p=0,007) ou com DAI (p=0,008). A porcentagem de célula Tefet foi similar nos grupos. A supressão de proliferação da célula Tefet pelas células Treg, medido por citometria de fluxo, após 7 dias de cultura celular, foi maior no grupo controle (p=0,003) comparado a SMD e DAI. A produção de IL10, TNF? e INF-? foi menor na SMD na cultura de Tefet isolada. A expressão gênica do éxon 2 do IRF-1 (p<0.02) e 4/5 (p<0.01) no sangue total foi menor nos pacientes com SMD comparado ao grupo de DAI. A expressão do FoxP3 na célula Treg foi similar entre os grupos (p=0,96). A concentração de CH100 foi menor na SMD que DAI (p=0,014). Quando avaliamos o estudo de forma prospectiva, o número de Treg (T0=5,6x105±2,8 vs T12=4,8x105±2,60; p=0.3) e porcentagem de Tefet (T0=16,8%±9,5 vs T12=13,1%±6,3; p=0.06) não alterou após 12 meses. A produção de todas as citocinas (IL2, IL4, IL6, IL10, TNF?, INF-?, IL17) foi significantemente maior no sobrenadante de cultura celular após 12 meses. A expressão relativa do exon 4/5 do IRF-1 aumentou no sangue total (p=0,001) e nas Treg (p<0.001) após 12 meses. Entretanto, a expressão do éxon 2 aumentou somente no sangue total (p<0.001), enquanto que a expressão do FoxP3 nas Treg não apresentou diferença estatística (p=0.57). Interessantemente, houve uma correlação positiva moderada entre Foxp3 e exon 4/5 do IRF-1 (R=0,659; p=0.002). Conclusão/DISCUSSÃO: Nossos resultados mostram uma diminuição de supressão da Tefet pela Treg em pacientes com SMD, apesar de apresentar maior número de célula Treg, sugerindo que a função regulatória pode estar alterada na SMD. Uma das explicações seria uma hiperativação do sistema imunitário, onde há necessidade de aumento de células Treg para controle imunológico. A produção de citocinas globalmente diminuída nos pacientes com SMD revela uma exaustão do sistema imunitário, posteriormente confirmada pelo consumo do complemento. Já na progressão da doença, a proliferação da Tefet e produção de citocina sugere uma piora da supressão pelas Treg e pode estar relacionada a disfunção de inibição por contato ou produção de citocina inibitória. A redução da expressão do IRF-1 nos pacientes com SMD apresentou um aumento importante durante a progressão. A baixa expressão do IRF-1 pode estar associada a progressão da doença. Entretanto, o IRF-1 está envolvido em várias funções do sistema immune e a alta expressão foi descrita nos pacientes com SMD com manifestações autoimunes. Em camundongos, o IRF-1 inibe a expressão do FoxP3 nas células Tregulatórias. Entretanto, nossos resultados mostram uma correlação positiva entre eles. Isso pode decorrer de uma indução de Foxp3 de forma desproporcional ao longo da evolução da doença.Dados abertos - Sucupira - Teses e dissertações (2013 a 2016