Detection of RAS family and BRAF mutations in circulating tumor cells in patients with metastatic colorectal cancer, with or without mutations at the primary tumor, who undergo treatment with biologic agents

1. Introduction: Approximately 40-50% of patients with colorectal cancer (CRC) harbor KRAS mutations and another 5-10% harbor BRAF mutations. The presence of these mutations is predictive for absence of benefit to anti-EGFR agents. Nevertheless, the emergence of resistance is inevitable due to multiple factors, such as the acquisition of KRAS mutations. As a result, proper patient selection and early therapy adaptation could lead to the optimization of patient management. Circulating tumor cell (CTC) enumeration is prognostic in metastatic CRC (mCRC), while their genotypic analysis carries predictive information. ISET (Rarecells, France) selects CTCs based on their size and it has been shown to capture diverse cellular populations in mCRC. The aim of this study was the genotypic analysis of CTCs captured by ISET. 2. Patients and methods: This prospective observational study, aiming to enumerate and characterize at the genomic level CTCs captured by ISET from patients with mCRC, was conducted at the Medical Oncology department, University Hospital of Heraklion. Following consent, CTC isolation using the ISET system was performed from prospectively collected blood samples obtained from patients with RAS and BRAF WT mCRC prior to first-line therapy initiation, at first imaging assessment and on disease progression. CTCs were enumerated based on previously published morphological criteria, using hematoxylin & eosin and CD45 double stain on a single membrane spot. DNA was extracted from 5 spots and KRAS exon 2 mutations were detected using a custom quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR) assay. 3. Results: In total, 28 patients were enrolled, 15 wild type (WT), 8 with a KRAS exon 2 mutation (6 harbored the G12D and 2 the G12V mutation), 1 with an exon 4 mutation (A146T), 1 NRAS and 3 with a BRAF mutation. 57 samples were collected; in all the samples, at least 1 CTC / 1 ml was identified, with a median of 6 CTCs / 1 ml (range, 1 – 32) and a mean of 8,22 CTCs / 1 ml. Both the number of CTCs and the number of clusters of 2 or more CTCs increased from baseline to response evaluation and then decreased; only differences in CTC clusters were statistically significant. Among the WT patients, 9/15 (60%) had at least one positive for a mutation sample (in total, 11/28 – 39.2% of samples). 3/11 (27%) patients had a positive baseline sample, while 3/8 (37.5%) samples at progression harbored a mutation. Out of these 3 patients, no previous mutations had been detected and 2 of them had been treated with an anti-EGFR agent. The most frequently detected mutations were G13D and G12C (n=3). Out of the 21 samples from patients with RAS mutated tumors, the G13D mutation was detected 6 times and G12V and G12C once. Finally, out of the 6 samples from 3 patients with a BRAF mutation, no such mutation could be detected in CTCs using Sanger sequencing. However, in one patient the STK11 F354L was detected in both CTCs and the primary tumor. The detection of mutations at baseline was not found to be prognostic for patient outcomes. 4. Discussion: In this study, the kinetics of CTCs isolated with ISET did not follow the disease trajectory as assessed by imaging. These results are in accordance with a published study from another group. Possible reasons are the low number of enrolled patients, the subjective nature of CTC characterization, the uncertain relative importance of the CTC populations that are captured by ISET and the phenomenon of CTC mobilization under the effect of systemic chemotherapy. This study serves as a proof-of-principle regarding the possibility for the genomic characterization of CTCs captured b ISET. The detection of mutations concerned patients with both WT and mutated primary tumors and was achieved in all the phases of first line therapy. The same point mutation identified in the primary tumor could not be identified in the patient’s CTC sample. Possible reasons could be methodology-related, due to the different methods used to detect mutations in the primary tumors and the CTCs or, lastly, this could be an accurate representation of the true molecular heterogeneity of the disease. Despite this study’s weaknesses, the genomic characterization of CTCs captured by ISET is feasible and could provide information regarding the heterogeneity and the emergent resistance while under treatment with an anti-EGFR agent before it is clinically detected. The standardization of the methodology is necessary before it is evaluated in larger scale clinical trials.1. Εισαγωγή: Περίπου 40-50% των περιπτώσεων ορθοκολικού καρκίνου (ΟΚΚ) παρουσιάζουν μεταλλάξεις στο γονίδιο KRAS και 5-10% στο γονίδιο BRAF. Η παρουσία ή μη των μεταλλάξεων έχει σημασία: μόνο οι RAS άγριου τύπου (wild type, WT) ασθενείς ωφελούνται από αντι-EGFR θεραπεία. Εντούτοις, η ανάδυση αντίστασης κατά τη θεραπεία με τα αντισώματα αυτά είναι αναπόφευκτη εξαιτίας μιας ποικιλίας μηχανισμών, όπως είναι οι νεοεμφανιζόμενες KRAS μεταλλάξεις. Έτσι, η κατάλληλη επιλογή ασθενών και η έγκαιρη τροποποίηση της θεραπείας ανάλογα με τους μηχανισμούς αντίστασης θα μπορούσε να βελτιστοποιήσει τη θεραπεία των ασθενών. Η μέτρηση των κυκλοφορούντων καρκινικών κυττάρων (ΚΚΚ) έχει σημαντική προγνωστική ισχύ σε ασθενείς με μεταστατικό ΟΚΚ (ΜΟΚΚ), ενώ η γονοτυπική τους ανάλυση παρουσιάζει προβλεπτική ισχύ για τη λήψη αντι-EGFR παραγόντων. Το σύστημα ISET (Rarecells, France) βασίζεται στην απομόνωση βάσει του μεγέθους των κυττάρων και έχει δειχθεί ότι απομονώνει ευρύ πληθυσμό ΚΚΚ από ασθενείς με ΜΟΚΚ. Στόχος της διατριβής ήταν ο γονοτυπικός χαρακτηρισμός των ΚΚΚ που απομονώνονται με το σύστημα ISET. 2. Ασθενείς και μέθοδοι: Επρόκειτο για μια προοπτική μελέτη παρατήρησης με στόχο την καταμέτρηση και μοριακό χαρακτηρισμό των ΚΚΚ που απομονώνονται από ασθενείς με ΜΟΚΚ και η οποία πραγματοποιήθηκε στην Παθολογική – Ογκολογική κλινική του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ηρακλείου. Ασθενείς με ιστολογικά επιβεβαιωμένο ΜΟΚΚ και μη προηγούμενη λήψη θεραπείας για μεταστατική νόσο εντάσσονταν κατόπιν έγγραφης συγκατάθεσης. Δείγματα 10 ml αίματος λαμβάνονταν αμέσως πριν την έναρξη θεραπείας, κατά την στιγμή της ακτινολογικής εκτίμησης της νόσου και κατά τη διαπίστωση εξέλιξης της νόσου και η επεξεργασία με το σύστημα ISET γινόταν εντός 2 ωρών. Μία θέση (spot) από τη μεμβράνη του ISET χρησιμοποιήθηκε για την καταμέτρηση των ΚΚΚ με βάση κυτταρομορφολογικά κριτήρια, χρησιμοποιώντας διπλή ανοσοϊστοχημική χρώση με αντι-CD45 αντίσωμα για την αρνητική επιλογή αιμοποιητικών κυττάρων και χρώση αιματοξυλίνης – ηωσίνης. Η απομόνωση του DNA γινόταν από 5 spot της μεμβράνης ISET κάθε δείγματος. Στο απομονωθέν γενετικό υλικό ακολούθησε ποσοτική αντίδραση αλυσωτής πολυμεράσης (qPCR) για την ανίχνευση των μεταλλάξεων KRAS εξώνιο 2. 3. Αποτελέσματα: Συνολικά εντάχθηκαν 28 ασθενείς, 15 ήταν WT, 8 είχαν μετάλλαξη στο εξώνιο 2 του KRAS (6 τη μετάλλαξη G12D και 2 τη G12V), 1 στο εξώνιο 4 (Α146Τ), 1 στο γονίδιο NRAS και 3 στο γονίδιο BRAF. Ελήφθησαν 57 δείγματα ΚΚΚ και σε όλα ανιχνεύθηκε τουλάχιστον 1 ΚΚΚ / 1 ml αίματος, με διάμεση τιμή ΚΚΚ=6 (εύρος, 1 – 32) και μέση τιμή 8.22 ΚΚΚ / 1 ml. Tόσο ο αριθμός των συνολικών ΚΚΚ όσο και των αθροίσεων 2 ή περισσοτέρων κυττάρων (διάμεση και μέση τιμή) έχουν αυξητική τάση από την 1η (baseline) στη 2η αιμοληψία, ενώ στη συνέχεια ο αριθμός τους πέφτει ξανά. Μόνο η αύξηση των αθροίσεων ήταν στατιστικά σημαντική. Μεταξύ των ασθενών με WT πρωτοπαθή όγκο, οι 9/15 (60%) είχαν τουλάχιστον 1 θετικό για μετάλλαξη δείγμα, 11/28 (39.2%) σε επίπεδο δειγμάτων. Κατά την αρχική αιμοληψία, 3/11 ασθενείς (27%) βρέθηκε να έχουν μετάλλαξη KRAS στο εξώνιο 2 ενώ κατά την εξέλιξη της νόσου, 3/8 δείγματα ήταν θετικά για την παρουσία μετάλλαξης (37.5%). Από τους 3 αυτούς ασθενείς, σε κανέναν δεν είχε ανιχνευθεί αντίστοιχη μετάλλαξη σε προηγούμενη αιμοληψία και 2 εξ αυτών είχαν λάβει θεραπεία με αντι-EGFR παράγοντα. Οι συχνότερα εντοπιζόμενες μεταλλάξεις ήταν οι G13D και G12C (n=3). Από τα 21 δείγματα ΚΚΚ από ασθενείς με RAS mutated πρωτοπαθείς, διαπιστώθηκε η μετάλλαξη G13D σε 6 δείγματα και από 1 φορά οι G12V και G12C. Τέλος, ήταν διαθέσιμα 6 δείγματα από 3 ασθενείς με τη BRAF V600E μετάλλαξη. Σε κανένα δεν διαπιστώθηκε η μετάλλαξη με τη χρήση αλληλούχισης κατά Sanger. Όμως, σε έναν ασθενή διαπιστώθηκε στο δείγμα εξέλιξης της νόσου η μετάλλαξη STK11 F354L η οποία επίσης ανευρέθηκε στον πρωτοπαθή όγκο του ασθενούς. Η ανίχνευση μετάλλαξης στο baseline δείγμα δεν προέβλεπε την έκβαση των ασθενών. 4. Συζήτηση: Στην παρούσα μελέτη φάνηκε ότι η κινητική των ΚΚΚ μετά από απομόνωση με τη μέθοδο ISET δεν ακολουθούσε την πορεία των ασθενών με ΜΟΚΚ όπως αυτή εκτιμήθηκε με τις απεικονιστικές μεθόδους. Τα αποτελέσματα αυτά έρχονται σε συμφωνία και με τα αποτελέσματα άλλης ομάδας. Πιθανές ερμηνείες αποτελούν ο μικρός αριθμός των ασθενών που εντάχθηκαν στη μελέτη, η υποκειμενική φύση του χαρακτηρισμού των ΚΚΚ βάσει μορφολογικών κριτηρίων, η αμφίβολη σημασία του ευρέος πληθυσμού ΚΚΚ που απομονώνεται με το ISET και, τέλος, το φαινόμενο της κινητοποίησης των ΚΚΚ από τους όγκους λόγω της χορηγούμενης θεραπείας. Η τρέχουσα μελέτη αποτελεί κατά βάση μία απόδειξη αρχής σχετικά με τη δυνατότητα γονοτυπικής ανάλυσης των ΚΚΚ που απομονώνονται με το σύστημα ISET. Η ανίχνευση μεταλλάξεων αφορούσε τόσο WT όσο και μεταλλαγμένους πρωτοπαθείς όγκους και επιτεύχθηκε σε όλες τις φάσεις της θεραπεία πρώτης γραμμής. Σημειακή μετάλλαξη ανιχνεύσιμη στον πρωτοπαθή όγκο δεν έγινε δυνατό να ανιχνευθεί στα ΚΚΚ. Tο γεγονός αυτό έχει πολλές πιθανές ερμηνείες: μεθοδολογικά θέματα, η ασυμφωνία να οφείλεται στην διαφορετική τεχνική με την οποία έγιναν τα δείγματα των ΚΚΚ με τον πρωτοπαθή όγκο ή, τέλος, η εικόνα αυτή να είναι αντιπροσωπευτική της αληθινής μοριακής ετερογένειας. Παρά τις αδυναμίες της μελέτης, ο μοριακός χαρακτηρισμός των ΚΚΚ που απομονώνονται με το σύστημα ISET είναι εφικτός και μπορεί να δώσει πληροφορίες σχετικά με τη γενετική ετερογένεια της νόσου και την ανάδυση αντίστασης στην αντι-EGFR θεραπεία πριν αυτή να γίνει κλινικά αντιληπτή. Η προτυποποίηση των χρησιμοποιούμενων μεθόδων είναι απαραίτητο βήμα πριν αυτές αξιολογηθούν σε μεγαλύτερης κλίμακας κλινικές μελέτες

Targeting the PD-1/PD-L1 axis in the treatment of lung cancer

In recent years major advances in the field of molecular profiling of non-small cell lung cancer led to the identification of targetable driver mutations and revolutionized the treatment of specific patient subsets. However, the majority of NSCLC tumors do not harbor these genomic events. On the other hand, current studies have confirmed an expanding role for immunotherapy in lung cancer and new agents, such as inhibitors of the programmed cell death-1 (PD-1)/programmed cell death ligand 1 (PD-L1) axis have been introduced in the treatment armamentarium. The monoclonal antibodies nivolumab and pembrolizumab targeting PD-1 resulted in superior survival when compared to standard second line chemotherapy within the context of randomized trials and received regulatory approval. Moreover, several other anti-PD-L1 antibodies have demonstrated encouraging preliminary efficacy and multiple clinical trials in various settings during the disease trajectory are currently underway. Early immunotherapy trials have also illustrated the potential of PD-1 blockade in small cell lung cancer treatment, a disease for which major advances in systemic therapy are lacking. The currently available clinical data on PD-1/PD-L1 inhibition in lung cancer are summarized in this review

The interplay between eosinophils and T cells in breast cancer immunotherapy

Treatment with immune checkpoint inhibitors (ICI) has revolutionized cancer management for multiple tumor types, including breast cancer. However, not all patients respond to ICI, and unraveling the determinants and mechanisms of response still remains an unmet need. A recent study has uncovered the critical role of eosinophils in mediating immunotherapy effect in breast cancer, mainly by stimulating the activation of CD8+ T‐cells. Furthermore, the intratumoral eosinophil recruitment was directed by CD4+ T cells and the interleukins IL‐5 and IL‐33, thus providing the rationale for targeting eosinophils to enhance ICI response

The Place of Targeted Agents in the Treatment of Elderly Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Despite the high prevalence of colorectal cancer in a continuously aging population and the substantial advances in the treatment of metastatic disease during the past decade, the treatment of elderly patients with advanced, unresectable or metastatic colorectal cancer is a clearly unmet need. Since older patients are under-represented or even excluded from randomized trials, the evidence that oncologists use as guidance is weak. However, small prospective studies, pooled analyses and observational studies show that combination approaches are safe, efficacious and feasible in the geriatric population with metastatic colorectal cancer. The use of biologic agents targeting angiogenesis and the epidermal growth factor receptor, which have been shown to clearly improve outcomes in multiple prospective trials in patients with advanced colorectal cancer, is a vital component of the aforementioned combination approaches. Herein, we review all available data concerning the management of elderly patients with these agents and underscore the differences between this age subgroup and younger patients

Beyond PD-1/PD-L1 Inhibition: What the Future Holds for Breast Cancer Immunotherapy

Cancer immunotherapy has altered the management of human malignancies, improving outcomes in an expanding list of diseases. Breast cancer - presumably due to its perceived low immunogenicity - is a late addition to this list. Furthermore, most of the focus has been on the triple negative subtype because of its higher tumor mutational load and lymphocyte-enriched stroma, although emerging data show promise on the other breast cancer subtypes as well. To this point the clinical use of immunotherapy is limited to the inhibition of two immune checkpoints, Programmed Cell Death Protein 1 (PD-1) and Cytotoxic T-lymphocyte-associated Protein 4 (CTLA-4). Consistent with the complexity of the regulation of the tumor − host interactions and their lack of reliance on a single regulatory pathway, combinatory approaches have shown improved efficacy albeit at the cost of increased toxicity. Beyond those two checkpoints though, a large number of co-stimulatory or co-inhibitory molecules play major roles on tumor evasion from immunosurveillance. These molecules likely represent future targets of immunotherapy provided that the promise shown in early data is translated into improved patient survival in randomized trials. The biological role, prognostic and predictive implications regarding breast cancer and early clinical efforts on exploiting these immune-related therapeutic targets are herein reviewed