In vivo Genkorrektur mittels modifizierter mRNA-Nukleasen am murinen Modell der Surfactant Protein-B Defizienz

Zink-Finger- bzw. transcription activator-like effector-Nukleasen (ZFNs/TALENs) sind vielversprechende Werkzeuge im Zuge der Reparatur genomischer Mutationen, indem diese den Mechanismus der Homologen Rekombination begünstigen. In Studien zur Hämophilie konnte bereits eine Nuklease-vermittelte Genkorrektur unter Verwendung von AAV-Vektoren demonstriert werden. Dabei kodierten diese sowohl für die Doppelstrangbruch- (DSB) induzierenden ZFN-Nukleasen, als auch den Einbau des Reparatur-Templates durch den Reparaturmechanismus der Homologen Rekombination (HDR, engl. homology-directed repair). Während der Einsatz von stabil exprimierenden AAV-Vektoren zwar als sicher angesehen werden kann, ist eine transiente Expression von Nukleasen ausreichend, um genomische Modifikationen zu erzeugen. Demzufolge wäre die zeitlich begrenzte Expression von ZFNs ein entscheidender Vorteil, um potentielle Nuklease-bedingte Nebeneffekte zu reduzieren. In den letzten Jahren hat sich als Alternative zu traditionellen, viralen gentherapeutischen Vektoren, modifizierte messenger RNA (mRNA) als vielversprechend herausgestellt. Dessen Vorteile liegen sowohl in einer transienten Proteinexpression, bei gleichzeitiger Vermeidung genomischer Integration, als auch in dessen chemischen Modifizierungen, die eine stabile Expression und das Ausbleiben von Immunantworten begünstigen. Eine solche Co-Transfektion mRNA-kodierender Nukleasen in einem gentherapeutischen Kontext macht mRNA daher zu einem idealen Vehikel. In dieser Studie wurden solche optimierten mRNA-kodierenden Nukleasen verwendet, um die erfolgreiche Genkorrektur am murinen Modell der SP-B Defizienz zu demonstrieren. Für die Genkorrektur des SP-B Lokus wurde zunächst ein Panel aus in silico generierten ZFNs und TALENs hergestellt. Der dual-luciferase single-strand Assay sowie der T7-Endonuklease I -Assay verifizierten für TALEN-1 (T1) und ZFN-3 (Z3) eine hohe Schnitt-Effizienz ex vivo, wodurch bis zu 39 % der Allele durch das nicht-homologe end-joining (NHEJ) repariert wurden. Im Gegensatz zu Plasmid-DNA (pDNA) stieg dabei die Induktion an DSBs signifikant an (P < 0,05). Die Kombination mit einem Reparatur-Template, welches eine NheI-Restriktionsschnittstelle in den SP-B Lokus einfügte, konnte ebenfalls ein signifikanter Anstieg in der HDR für mRNA verzeichnet werden (P < 0,05). Da Z3 effizienter in der DSB-Induktion sowie der HDR war, wurde diese für alle folgenden Experimente verwendet. Zur Optimierung der Z3-Expression in vivo wurden zwei Modifikationen (Ψ(1.0)/m5C(1.0) und s2U(0.25)/m5C(0.25)) mit und ohne Komplexierung in mit Chitosan-beschichteten poly(D,L-Laktid-Co-Glycolid) Nanopartikeln (NPs) getestet. Dabei ergaben sich für markierte s2U(0.25)/m5C(0.25) Z3 mRNA (im Weiteren als Z3 nec-mRNA bezeichnet) mit NPs die höchsten Expressionslevel- nach intratrachealer (i.t.) Applikation in die Lunge. Über einen IFN-α ELISA wurde zusätzlich ein signifikanter immunstimulatorischer Effekt der Z3 nec-mRNA ausgeschlossen. Die sequenzspezifische HDR wurde anschließend ex vivo über die Co-Applikation eines CAG-Promoter enthaltenden AAV- Donor-Templates (AAV6-Donor) zusammen mit AAV-kodierender Z3 (Z3 AAV) oder Z3 nec-mRNA erfolgreich getestet. Diese gentherapeutische Manipulation zeigte sich ebenfalls in Gen-korrigierten, transgenen SP-B Mäusen mit signifikant höheren Überlebensraten als die der Mock-behandelten Gruppen (P < 0,001). Korrigierte SP-B Mäuse zeigten dabei eine normale Lungenfunktion im Vergleich zu Positivkontrollen. Ebenfalls wurde im Vergleich zu PBS-behandelten Mäusen kein signifikanter Anstieg in der IL-12 Produktion beobachtet. Sequenzspezifische DSB-Induktion sowie HDR bestätigten die Ausprägung eines normalen Phänotyps, wobei zwischen Z3 AAV und Z3 nec-mRNA keine Unterschiede zu erkennen waren. Die immunhistochemischen Analysen bestätigten zusätzlich die zeitlich limitierte Expression der Z3 nec-mRNA im Vergleich zu Z3 AAV. Die hier erhaltenen Ergebnisse bestätigen eindrucksvoll, dass die Applikation von nec-mRNA in Kombination eines AAV-Donors zur erfolgreichen Genkorrektur des transgenen SP-B Lokus führt und somit die konstitutive SP-B Expression sowie eine normale Lungenfunktion nach Absetzen von Doxycyclin erlaubt. Verglichen mit AAV, zeigte Z3 nec-mRNA eine zeitlich limitierte Nuklease-Expression, wodurch mögliche Nebeneffekte im Gegensatz zu dauerhaft aktiven AAV-Nukleasen reduziert werden können. Zusätzlich macht die Abwesenheit einer Immunantwort nec-mRNA zu einem idealen Vehikel für mehrmalige Applikationen hinsichtlich einer dauerhaften Genkorrektur der Lunge. Zusammengefasst besitzt nec-mRNA damit ein enormes Potential im Zuge klinisch relevanter, gentherapeutischer Strategien für die Behandlung erblich-bedingter Lungenerkrankungen sowie weiterer monogenetischer Defekte

Transcriptomic profile of cystic fibrosis patients identifies type I interferon response and ribosomal stalk proteins as potential modifiers of disease severity.

Cystic Fibrosis (CF) is the most common monogenic disease among people of Western European descent and caused by mutations in the CFTR gene. However, the disease severity is immensely variable even among patients with similar CFTR mutations due to the possible effect of 'modifier genes'. To identify genetic modifiers, we applied RNA-seq based transcriptomic analyses in CF patients with a mild and severe lung phenotype. Global gene expression and enrichment analyses revealed that genes of the type I interferon response and ribosomal stalk proteins are potential modifiers of CF related lung dysfunction. The results provide a new set of CF modifier genes with possible implications as new therapeutic targets for the treatment of CF

IL-8 expression by qPCR and RNA seq.

<p><b>A</b>) Dot-plot shows the expression of IL-8 in severe and mild CF patients. Expression was normalized using <i>18s</i> as a reference gene. Results represent mean values and are expressed as Log₂ values of the fold change. <b>B</b>) Using the same data of <a href="http://www.plosone.org/article/info:doi/10.1371/journal.pone.0183526#pone.0183526.g002" target="_blank">Fig 2A</a> for IL-8 to understand different results between platforms.</p

Primer details and PCR cycling conditions for the qPCR validation.

<p>Primer details and PCR cycling conditions for the qPCR validation.</p

qPCR validation of RNA-seq findings.

<p><b>A)</b> Expression profile of RNA-seq data and qPCR data for selected genes were compared using the same samples. Severe CF samples were used as control group and the expression level set to 1 or -1. Expression was normalized using <i>18s</i> as a reference gene. Results represent mean values and are expressed as Log₂ values of the fold change. Significant difference observed in qPCR results between mild CF and severe CF patients (**<i>P</i> value < 0.05; ***<i>P</i> value < 0.001). The level of significance was set to a <i>P</i>-value of < 0.0001 for RNA-seq data. <b>B)</b> Correlation analysis of RNA-seq and qPCR. (Log₂ values of the fold change; Spearman’s rho, ρ = 0.53, <i>P</i> value = 0.04).</p