Directed Mutagenesis for Arginine Substitution of a Phaseolus acutifolius Recombinant Lectin Disrupts Its Cytotoxic Activity

Recently, we reported that a recombinant Tepary bean (Phaseolus acutifolius) lectin (rTBL-1) induces apoptosis in colon cancer cell lines and that cytotoxicity was related to differential recognition of β1-6 branched N-glycans. Sequencing analysis and resolution of the rTBL-1 3D structure suggest that glycan specificity could be strongly influenced by two arginine residues, R103 and R130, located in the carbohydrate binding pocket. The aim of this work was to determine the contribution of these residues towards cytotoxic activity. Two rTBL-1 mutants were produced in Pichia pastoris, biochemically characterized, and cytotoxic effects were evaluated on human colorectal cancer cells (HT-29). Substitution of either of the arginine residues with glutamines resulted in significant reductions in cytotoxic activity, with losses of 1.5 and 3 times for R103 and R130, respectively. Docking analysis showed that the mutations decreased lectin affinity binding to some Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR)-related N-glycans. Together, these findings confirm that both of the selected arginine residues (R103 and R130) play a key role in the recognition of tumor cell glycoconjugates by rTBL-1

Proteínas Involucradas en los Mecanismos de Defensa de Plantas

Las plantas careciendo de un sistema de defensa basado en anticuerpos similar al que existe en animales, basan su protección en características físicas y en una serie de componentes que la propia planta sintetiza. Dentro de esos compuestos, las proteínas constituyen una de las principales fuentes de defensa, no sólo por su elevada especificidad y eficiencia, sino porque además algunas de ellas son altamente reguladas, respondiendo su síntesis al ataque de los depredadores (insectos) o de los patógenos. Estas proteínas representan una interesante alternativa para producir plantas con mejores características de resistencia, ya que a través de mecanismos de fitomejoramiento o bien introduciendo el gen a plantas sensibles, por medio de la ingeniería genética. El conocimiento de sus mecanismos de acción representa una forma importante para aprender a combatir plagas y enfermedades de las plantas, sin tener que utilizar compuestos altamente contaminantes, como son los insecticidas comerciales. </jats:p

Potencial y Algunos de los Mecanismos de Acción de los Hongos Entomopatógenos para el Control de Insectos Plaga

El presente artículo enfatiza el uso de una alternativa ecológica para el control efi caz de plagas. Considerando que existe una preocupación general sobre los efectos negativos de los pesticidas químicos en la salud pública y/o en el medio ambiente, una alternativa consiste en el aprovechamiento de patógenos naturales de insectos. El uso de hongos entomopatógenos (HEP) como agentes de control biológico ha sido considerado a nivel mundial; estos hongos son ampliamente reconocidos por su potencial como agentes de control biológico. Debido a su modo de infección distintivo, los hongos pueden tener un papel único o complementario como agentes de control de insectos plaga. A diferencia de otros agentes entomopatógenos, como bacterias, virus o protozoarios, los HEP no requieren ser ingeridos por su hospedero para causar la infección; en su lugar, las esporas pueden penetrar directamente a través de la cutícula. Este modo de infección es posible gracias a la acción coordinada de enzimas hidrolíticas, además de la presión mecánica ejercida en el punto de contacto. Las enzimas participantes son factores determinantes en el éxito de la infección. </jats:p

Proteínas Involucradas en los Mecanismos de Defensa de Plantas

Las plantas careciendo de un sistema dedefensa basado en anticuerpos similar al que existe en animales, basan su protección en características físicas y en una serie de componentes que la propia planta sintetiza. Dentro de esos compuestos, las proteínas constituyen una de las principales fuentes de defensa, no sólo por su elevada especificidad y eficiencia, sino porque además algunas de ellas son altamente reguladas, respondiendo su síntesis al ataque de los depredadores (insectos) o de los patógenos. Estas proteínas representan una interesante alternativa para producir plantas con mejores características de resistencia, ya que a través de mecanismos de fitomejoramiento o bien introduciendo el gen a plantas sensibles, por medio de la ingeniería genética. El conocimiento de sus mecanismos de acción representa una forma importante para aprender a combatir plagas y enfermedades de las plantas, sin tener que utilizar compuestos altamente contaminantes, como son los insecticidas comerciales.The plants lacking a defense system based on similar antibodies to which exists in animals, bases their protection on physical characteristics and in a series of components that the own plant synthesizes. Inside those compounds, the proteins constitute one of the main defense sources, not only for their high specificity and efficiency, but because some of them are also highly regulated, their synthesis responding to the attack of the insects or by pathogens. These proteins represent an interesting alternative to produce plants with better resistance characteristics, since through breeding mechanisms or introducing the gene a susceptible plant, by means of the genetic engineering. The knowledge of its action mechanisms represents an important form to learn how to combat plagues and illnesses of the plants, without having to use compound highly polluting, like the commercial insecticides

Expression of Lectins in Heterologous Systems

Lectins are proteins that have the ability to recognize and bind in a reversible and specific way to free carbohydrates or glycoconjugates of cell membranes. For these reasons, they have been extensively used in a wide range of industrial and pharmacological applications. Currently, there is great interest in their production on a large scale. Unfortunately, conventional techniques do not provide the appropriate platform for this purpose and therefore, the heterologous production of lectins in different organisms has become the preferred method in many cases. Such systems have the advantage of providing better yields as well as more homogeneous and better-defined properties for the resultant products. However, an inappropriate choice of the expression system can cause important structural alterations that have repercussions on their biological activity since the specificity may lay in their post-translational processing, which depends largely on the producing organism. The present review aims to examine the most representative studies in the area, exposing the four most frequently used systems (bacteria, yeasts, plants and animal cells), with the intention of providing the necessary information to determine the strategy to follow in each case as well as their respective advantages and disadvantages

Inhibidores de proteasas de plantas efectivos contra las aspártico proteasas de Hypothenemus hampei

La broca del café (Hypothenemus hampei), produce las pérdidas económicas más graves al cultivo de café (Coffea arabica). En extractos proteínicos de insectos adultos se identificaron aspártico proteasas las cuales mostraron dos bandas de actividad proteolítica en los zimogramas y una actividad máxima a pH 2,5 en los ensayos espectrofotométricos. Esta enzima se clasificó como catepsina D considerando su inhibición por pepstatina A y la hidrólisis de hemoglobina. Para encontrar inhibidores de las aspártico proteasas de H. hampei, se evaluaron extractos proteínicos de semillas de plantas no-huésped como: Lupinus bogotensis, Brachiaria humidicola, Amaranthus hypochondriacus, Phaseolus acutifolius, Phaseolus coccineus, Hyptis suaveolens, Centrosema pubescens y Trifolium repens. El extracto proteínico de L. bogotensis produjo la mayor inhibición de las aspártico proteasas con una actividad específica de 74,1 UI/mg; en comparación con los extractos de H. suaveolens, B. humidicola y A. hypochondriacus que presentaron una inhibición menor de las aspártico proteasas. Los demás extractos proteínicos no inhibieron la actividad aspártico proteasa. La actividad proteolítica de H. hampei se inhibió en un 90% con 100 g del extracto crudo de L. bogotensis, mientras que se necesitó 1 mg de extracto crudo de H. suaveolens y B. humidicola para inhibir la actividad en 70 y 60%, respectivamente. Los zimogramas identificaron posibles inhibidores de proteasas en los extractos de L. bogotensis, H. suaveolens, B. humidicola y A. hypochondriacus que bloquearon in vitro la actividad de las aspártico proteasas del insecto. La expresión de genes de inhibidores de proteasas en café es una alternativa para obtener variedades resistentes.</jats:p