Etude des voies de signalisation en aval de Ras impliquées dans le contrôle de la division et de la différenciation de cellules nerveuses

L'oncoprotéine Ras est une GTPase membranaire retrouvée fréquemment mutée dans les tumeurs humaines. La transformation de fibroblastes induite par Ras est médiée par différentes voies de signalisation. Plusieurs effecteurs de Ras participant aux processus de transformation cellulaire ont été mis en évidence chez les vertébrés. Il s'agit des kinases de la famille Raf, responsables de l'activation de la voie MAPK, de la sous-unité catalytique de la PI-3 Kinase (p110) et des facteurs d'échange de la GTPase Ra1. En utilisant des mutants de Ras générés pour leur capacité à n'interagir qu'avec un seul de ces effecteurs, nous avons montré que l'activation constitutive de chacune de ces voies en aval de Ras était capable d'induire la division de cellules de neurorétine (NR) en voie de différenciation. Ces mutants sont également capables de réprimer le promoteur du gène QR1, un gène exprimé spécifiquement dans les cellules NR quiescentes. De plus, en utilisant des versions constitutivement actives ou dominantes négatives de molécules situées en aval de Ras, nous avons démontré la nécessité d'une coopération entre les voies Raf/MAPK et PI-3K/Rac pour l'induction de la prolifération cellulaire. Enfin, nos résultats suggèrent également la mise en place d'une boucle autocrine/paracrine requise pour ce processus. La régulation de B-Raf, l'un des effecteurs majeurs de Ras a également été étudiée. B-Raf code de multiples isoformes générées par épissage alternatif. La présence des séquences alternatives module les propriétés biochimiques et biologiques de B-Raf. En particulier, la présence de l'exon alternatif 10 augmente l'affinité de B-Raf pour son substrat MEK et sa capacité à le phosphoryler. En utilisant les cellules PC12, un modèle de différenciation neuronale in vitro, nous avons mis en évidence un effet de l'exon 10 sur la régulation de l'activité de B-Raf par phosphorylation.The oncoprotein Ras is a membrane-associated GTPase frequently mutated in human cancers. Transformation of fibroblastic cell lines by Ras is mediated through distinct downstream signaling pathways. Several effectors of Ras have been described in vertebrates, including Raf family kinases, responsible for MAPK pathway activation, the catalytic subunit of phosphatidylinositol 3-kinase (p110) and the exchange factors of the Ra1 GTPase. By using Ras mutants, which interact preferentially with only one Ras effector, we have shown that constitutive activation of each Ras downstream signaling pathway was able to induce division of postmitotic and differentiating neuroretina (NR) cells. In addition, these mutants can repress the promoter activity of QR1, a gene specifically expressed in quiescent NR cells. Moreover, by using constitutive and dominant negative mutants of components lying in the downstream signaling pathways, we established the requirement of a cooperation between Raf/MAPK and PI3K/Rac pathways. Finally, the activation of these two pathways possibly relies on an autocrine or paracrine loop, involving endogenous Ras activity. We also studied the regulation of B-Raf, a major Ras effector. B-Raf encodes several isoforms resulting tram complex alternative splicing. The presence of alternative sequences modulates the biochemical and biological properties of B-Raf. In particular, the presence of alternative exon 10 increases the affinity of B-Raf for its substrate MEK and its ability to phopshorylate it. By using the PC12 cell line, an in vitro model of neuronal differentiation, we have disclosed an effect of exon 10 on the regulation of B-Raf activity by phosphorylation.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Rôle et régulation des isoformes de la MAPKinase Kinase Kinase B-Raf

La sérine/thréonine kinase B-Raf est impliquée dans de nombreux processus cellulaires chez les Métazoaires. Le gène B-raf code plusieurs isoformes résultant d'épissage alternatif. La présence des séquences codées par les exons alternatifs 8b et 9b, situées entre le domaine régulateur et le domaine kinase de B-Raf, module les propriétés biochimiques et oncogéniques de B-Raf : l'exon 9b augmente l'activité kinase et l'interaction avec MEK, l'exon 8b les diminue. Mon travail de thèse a eu pour objectif à la fois de comprendre les bases moléculaires du mécanisme de régulation différentielle des isoformes de B-Raf et également d'analyser leur importance fonctionnelle. J'ai ainsi montré que la présence des séquences codées par les exons 8b et 9b interférent avec l'autoinhibition du domaine régulateur sur le domaine kinase. Ces séquences interfèrent également avec la phosphorylation des résidus S365 et S429 situés dans la même région charnière, indépendamment des interactions intramoléculaires. Ainsi, alors que le niveau de phosphorylation de la S365 est modulé par la présence des exons, la phosphorylation de la S429 n'est pas modulée par les séquences alternatives mais aurait des conséquences différentes en fonction de l'isoforme. D'autre part, afin de comprendre le rôle physiologique des isoformes de B-Raf contenant les séquences codées par les exons 8b et 9b, nous avons généré des lignées de souris pour lesquelles la délétion conditionnelle de ces exons est rendue possible grâce à l'approche Cre/Lox. L'obtention de souris invalidées pour les exons 8b et 9b permettra de mieux comprendre le rôle spécifique des isoformes de B-Raf, en particulier au cours du développement.The B-Raf serine/threonine kinase is involved in many cellular processes in Metazoans. The B-raf gene encodes several isoforms resulting from alternative splicing. The presence of the sequences encoded by exons 8b and 9b, located between the regulation domain and the kinase domain of B-Raf, modulates the biochemical and oncogenic properties of B-Raf: the exon 9b increases the kinase activity and the interaction with MEK, the exon 8b decreases them. My work aimed at the same time to understand the molecular basis of the mechanism of differential regulation of B-Raf isoforms and also to analyze their functional roles. I thus showed that the presence of the sequences encoded by exons 8b and 9b interferes with the autoinhibition of the regulation domain on the kinase domain. These sequences also interfere with phosphorylation of the residues S365 and S429 located in the same hinge region, independently of the intramolecular interactions. Thus, whereas the phosphorylation level of S365 is modulated by the presence of exons, the phosphorylation of S429 is not modulated by the alternative sequences but would have different consequences according to the isoform. In addition, in order to understand the physiological role of the B-Raf isoforms containing the sequences encoded by exons 8b and 9b, we generated mice strain lines in which the conditional deletion of these exons is possible by a Cre/Lox strategy. Obtaining mice invalidated for exons 8b and 9b will render possible to better understand the specific role of B-Raf isoforms, especially during development.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF

Dual function of MyD88 in RAS signaling and inflammation, leading to mouse and human cell transformation

Accumulating evidence points to inflammation as a promoter of carcinogenesis. MyD88 is an adaptor molecule in TLR and IL-1R signaling that was recently implicated in tumorigenesis through proinflammatory mechanisms. Here we have shown that MyD88 is also required in a cell-autonomous fashion for RAS-mediated carcinogenesis in mice in vivo and for MAPK activation and transformation in vitro. Mechanistically, MyD88 bound to the key MAPK, Erk, and prevented its inactivation by its phosphatase, MKP3, thereby amplifying the activation of the canonical RAS pathway. The relevance of this mechanism to human neoplasia was suggested by the finding that MyD88 was overexpressed and interacted with activated Erk in primary human cancer tissues. Collectively, these results show that in addition to its role in inflammation, MyD88 plays what we believe to be a crucial direct role in RAS signaling, cell-cycle control, and cell transformation