Etude des voies de signalisation en aval de Ras impliquées dans le contrôle de la division et de la différenciation de cellules nerveuses

Abstract

L'oncoprotéine Ras est une GTPase membranaire retrouvée fréquemment mutée dans les tumeurs humaines. La transformation de fibroblastes induite par Ras est médiée par différentes voies de signalisation. Plusieurs effecteurs de Ras participant aux processus de transformation cellulaire ont été mis en évidence chez les vertébrés. Il s'agit des kinases de la famille Raf, responsables de l'activation de la voie MAPK, de la sous-unité catalytique de la PI-3 Kinase (p110) et des facteurs d'échange de la GTPase Ra1. En utilisant des mutants de Ras générés pour leur capacité à n'interagir qu'avec un seul de ces effecteurs, nous avons montré que l'activation constitutive de chacune de ces voies en aval de Ras était capable d'induire la division de cellules de neurorétine (NR) en voie de différenciation. Ces mutants sont également capables de réprimer le promoteur du gène QR1, un gène exprimé spécifiquement dans les cellules NR quiescentes. De plus, en utilisant des versions constitutivement actives ou dominantes négatives de molécules situées en aval de Ras, nous avons démontré la nécessité d'une coopération entre les voies Raf/MAPK et PI-3K/Rac pour l'induction de la prolifération cellulaire. Enfin, nos résultats suggèrent également la mise en place d'une boucle autocrine/paracrine requise pour ce processus. La régulation de B-Raf, l'un des effecteurs majeurs de Ras a également été étudiée. B-Raf code de multiples isoformes générées par épissage alternatif. La présence des séquences alternatives module les propriétés biochimiques et biologiques de B-Raf. En particulier, la présence de l'exon alternatif 10 augmente l'affinité de B-Raf pour son substrat MEK et sa capacité à le phosphoryler. En utilisant les cellules PC12, un modèle de différenciation neuronale in vitro, nous avons mis en évidence un effet de l'exon 10 sur la régulation de l'activité de B-Raf par phosphorylation.The oncoprotein Ras is a membrane-associated GTPase frequently mutated in human cancers. Transformation of fibroblastic cell lines by Ras is mediated through distinct downstream signaling pathways. Several effectors of Ras have been described in vertebrates, including Raf family kinases, responsible for MAPK pathway activation, the catalytic subunit of phosphatidylinositol 3-kinase (p110) and the exchange factors of the Ra1 GTPase. By using Ras mutants, which interact preferentially with only one Ras effector, we have shown that constitutive activation of each Ras downstream signaling pathway was able to induce division of postmitotic and differentiating neuroretina (NR) cells. In addition, these mutants can repress the promoter activity of QR1, a gene specifically expressed in quiescent NR cells. Moreover, by using constitutive and dominant negative mutants of components lying in the downstream signaling pathways, we established the requirement of a cooperation between Raf/MAPK and PI3K/Rac pathways. Finally, the activation of these two pathways possibly relies on an autocrine or paracrine loop, involving endogenous Ras activity. We also studied the regulation of B-Raf, a major Ras effector. B-Raf encodes several isoforms resulting tram complex alternative splicing. The presence of alternative sequences modulates the biochemical and biological properties of B-Raf. In particular, the presence of alternative exon 10 increases the affinity of B-Raf for its substrate MEK and its ability to phopshorylate it. By using the PC12 cell line, an in vitro model of neuronal differentiation, we have disclosed an effect of exon 10 on the regulation of B-Raf activity by phosphorylation.ORSAY-PARIS 11-BU Sciences (914712101) / SudocSudocFranceF