Infection dynamics of Theileria annulata over a disease season following cell line vaccination

Tropical theileriosis is a tick-borne haemoparasitic disease of cattle caused by the protozoan parasite Theileria annulata. Globally, the economic impact of the disease is immense and enhanced control measures would improve livestock production in endemic regions. Immunisation with a live attenuated vaccine is an effective and widely used control method, however, the repeated use of live vaccines may have an impact on the field parasite population at a genetic level. Additionally, there has been an increasing number of reports of vaccine breakthrough cases in recent years. Thus, the present study was designed to evaluate the genetic composition of a parasite population over a disease season in a locality where live cell line vaccination is practised. A diverse range of parasite genotypes was identified and every T. annulata positive cattle blood sample harboured multiple parasite genotypes. An alteration in the major genotype and an increasing multiplicity of infection in individual animals was observed over the course of the disease season. Vaccination status was found not to effect within-host multiplicity of infection, while a significantly higher number of genotypes was detected in grazed cattle compared to non-grazed ones. A degree of genetic isolation was evident between parasite populations on a micro-geographic scale, which has not been reported previously for T. annulata. Analysis of parasite genotypes in vaccinated animals suggested only a transient effect of the vaccine genotype on the genetic diversity of the T. annulata population. The vaccine genotype was not detected among clones of two vaccine ‘breakthrough’ isolates and there is no suggestion that it was responsible for disease. The obtained data indicated that in the system studied there is no apparent risk of introducing the vaccine genotype into the population with only a transient effect on the genetic diversity of the parasite population during the disease season

BATI EGE BÖLGESİ KEDİLERİNDE LEİSHMANİA TÜRLERİNİN MOLEKÜLER VE SEROLOJİK OLARAK BELİRLENMESİ

Leishmaniasis, 20'den fazla Leishmania türü protozoonunun neden olduğu zoonotik karakterli bir hastalıktır. Hastalık visseral, kutanöz, düffüzkütanöz ve mukokutanöz olmak üzere farklı formlarda görülmektedir. Birincil rezervuar konağı köpek kabul edilse de; tilki, çakal, küçük kemiriciler gibi pek çok memeliler de parazite rezervuarlık etmektedirler. Son yıllarda endemik bölgelerdeki kedilerde giderek artan sayıda olgu ile kedilerin tesadüfi bir konak olmaktan ziyade Leishmania türlerine rezervuarlık yapabileceği yönünde görüşler artmıştır. Batı Ege Bölgesi Leishmaniasis açısından endemik bir bölgedir. Bu doğrultuda, bu çalışmada Batı Ege Bölgesindeki sahipli ve sahipsiz kedilerdeki Leishmania varlığının moleküler ve serolojik olarak belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla Aydın, İzmir, Manisa ve Muğla illerinden toplamda 386 adet kedi kan örneği ve 301 adet kedi serum örneği toplanmıştır. RV1/RV2 primer çifti ile kan örneklerine Leishmania spp. cins düzeyinde PZR yapılmış ve %2,3 Leishmania spp. pozitif kedi saptanmıştır. IFA testi ile değerlendirilen 301 kedi serum örneğinde ise %15,8 oranında anti-Leishmania antikor varlığı tespit edilmiştir. Bu tez çalışmasında kedilerde Leishmania spp. ve L. infantum, L. tropica ve L. major varlığı gösterilmiştir.VT-17046İÇİNDEKİLER KABUL VE ONAY ........i TEŞEKKÜR ...... ii İÇİNDEKİLER ..... iii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ......vi ŞEKİLLER DİZİNİ ....viii RESİMLER DİZİNİ ..... ix TABLOLAR DİZİNİ ...... x ÖZET ..... xi ABSTRACT .... xii 1. GİRİŞ .......1 2. GENEL BİLGİLER .......3 2.1. Leishmaniasis Tarihçesi .......3 2.2. Leishmaniasis .......6 2.2.1. Kutanöz Leishmaniasis .......7 2.2.2. Mukokutanöz Leishmaniasis .......7 2.2.3. Visseral Leishmaniasis .......8 2.2.4. Diffüz Kutanöz Leishmaniasis .......8 2.3. Leishmaniasiste Taksonomi ve Morfoloji .......9 2.3.1.Amastigot Form .....10 2.3.2. Promastigot Form .....11 2.4. Leishmaniasis Yaşam Döngüsü .....13 2.5.Leishmaniasis Vektörü .....15 2.5.1.Leishmaniasiste Vektörle Mücadele .....19 2.6. Leishmaniasisin Klinik ve Patolojik Bulguları .....21 2.7. Leishmaniasiste Tanı .....23 2.7.1.Parazitolojik Tanı .....24 2.7.2. Serolojik Tanı .....25 2.7.3. Moleküler Tanı .....26 2.8. Leishmaniasiste Tedavi .....29 2.9. Leishmaniasise Karşı Bağışılık .....36 2.10.Leishmaniasiste Aşılama .....42 2.11.Leishmaniasis Epidemiyolojisi .....47 2.12. Kedilerde Leishmaniasis .....51 2.12.1. Kedi Leishmaniasisinde Patoloji ve Klinik Bulgular .....53 2.12.2. Kedilerde Leishmaniasise Karşı Gelişen Bağışıklık .....55 2.12.3. Kedilerde Leishmaniasis Tanısı .....56 2.12.4. Kedilerde Leishmaniasise Karşı Tedavi ve Korunma .....59 2.12.5. Kedilerde Vektörleri .....59 3.GEREÇ VE YÖNTEM .....63 3.1. Gereç .....63 3.1.1. Materyal Toplanması ve Örneklerin Hazırlanması .....63 3.1.2.Antijenlerin Hazırlanması .....64 3.2.Yöntem .....64 3.2.1.DNA Ekstraksiyonu .....64 3.2.2.İndirek Floresan Antikor (IFA) Testi .....65 3.2.3.Toplanan Örneklerin Leishmania spp. Yönünden Moleküler olarak İncelenmesi .....66 3.2.4.Leishmania spp. Pozitif Örneklerin Sekanslanması .....68 4.BULGULAR .....69 4.1. IFAT Bulguları .....69 4.2. PZR Bulguları .....70 4.2.1. Leishmania spp.’ye ait PZR Bulguları .....70 4.2.2. Leishmania spp. Pozitif Örneklerin Sekans Bulguları .....73 5.TARTIŞMA .....74 6.SONUÇ VE ÖNERİLER .....83 KAYNAKLAR .....85 EKLER ...135 ÖZGEÇMİŞ ...143 Ek 1. Aydın ilinden toplanan kedi serum ve kan örnekleri ...135 Ek 2. İzmir ilinden toplanan kedi serum ve kan örnekleri ...136 Ek 3. İzmir ilinden toplanan kedi serum ve kan örnekleri (devamı) ...137 Ek 4. Manisa ilinden toplanan kedi serum ve kan örnekleri ...138 Ek 5. Muğla ilinden toplanan kedi serum ve kan örnekleri ...139 Ek 6. Muğla ilinden toplanan kedi serum ve kan örnekleri (devamı) ...140 Ek 7. İkd-65 kodlu örneğe ait nükleotid blast sonucu ...141 Ek 8. İkd-72 kodlu örneğe ait nükleotid blast sonucu ...141 Ek 9. İkd-73 kodlu örneğe ait nükleotid blast sonucu ...141 Ek 10. Mak-14 kodlu örneğe ait nükleotid blast sonucu ...142 Ek 11. Mak-15 kodlu örneğe ait nükleotid blast sonucu ...142 SİMGELER VE KISALTMALAR AIDS : Edinsel bağışıklık yetmezlik sendromu BCG : Bacille Calmatte-Guerin BHR : Baylis-Hillman reaksiyonu BOS : Boyun omurilik sıvısı bp : Baz çifti CanL : Kanin leishmaniasis CIC : Dolaşımdaki bağışıklık kompleksi cPZR : Konvensiyonel Polimeraz Zincir Reaksiyonu DAT : Direkt antiglobülin testi DHFR-TS : Diazrofolat redüktaz timidilat kodlayan gen DNA : Deoksiribonükleik asit DDT : Diklorodifeniltrikloroetan DKL : Diffüz kutanöz leishmaniasis DMSA : Dimerkaptosüksinik asit EC50 : En etkili olan konsantrasyonun % 50’si ELISA : Enzim-linked immünosorbent testi FBS : Foetal bovine serum FeL : Felin leishmaniasis FeLV : Felin lösemi virüsü FIV : Felin immün yetmezlik virüsü GPI : Glikofosfatidilnotisol Gp63 : GPI bağlantılı moleküler yüzey proteazı HIV : İnsan immün yetmezlik virüsü IC50 : %50 azalmaya neden olan inhibitör konsantrasyonu IFAT : İmmün floresan antikor testi IFN : İnterferon Ig : İmmünglobülinler IL : İnterlökin kDa : Kilodalton kDNA : Kinetoplastid DNA KL : Kutanöz leishmaniasis KMP-11 : Kinetoplastid membran proteini-11 KO : Kojik asit KS : Konjunktival svab LPG : Lipofosfoglikan LPS : Lipopolisakkarit MC : Leishmania infantum’u çoğaltan primer MHC : Major doku uygunluk kompleksi MKL : Mukakutanöz leishmaniasis ml : Mililitre mM : Milimolar NBT : Nitroblue tetrazolium redüksiyon testi NO : Nitrik oksit OIE : Dünya Hayvan Sağlığı Örgütü PACA : Poli-alkil siyano akrilat PBS : Phosphate buffered saline PLGA : Poli laktik koglikolit asit Pmol : Pikomol PPG : Proteofosforilasyon PV : Parazitofor vakuol PZR : Polimeraz zincir reaksiyonu RNA : Ribonükleik asit rRNA : Ribozomal RNA RV : Leishmania spp.’yi çoğaltan primer TGF : Dönüştürücü büyüme faktörü TiAg : Gümüş katkılı titanyumdioksit TLR : Model tanıma reseptörü UV : Ultraviyole VL : Visseral leishmaniasis WHO : Dünya Sağlık Örgütü μl : Mikrolitre μg : Mikrogram ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1. Eski ve Yeni Dünya’da Ortaya Çıkmış Leishmania türleri 10 Şekil 2. Leishmania spp. yaşam döngüsü 15 Şekil 3. Örneklerin toplandığı iller 63 Şekil 4. Leishmania spp.’ya ait RV primer çifti ile PZR döngüsü 66 Şekil 5. Leishmania infantum’a ait MC primer çifti ile PZR döngüsü 67 Şekil 6. Real-Time PZR L. major, L .tropica, L. infantum pozitif kontroller erime eğrisi grafiği 72 Şekil 7. Real-Time PZR Leishmania spp. pozitif örneklerin erime eğrisi grafiği 73 RESİMLER DİZİNİ Resim 1. Leishmania spp. amastigot formu 11 Resim 2. Leishmania spp. promastigot formu 11 Resim 3. Kum sineği yaşam formları 17 Resim 4. Dişi kum sineği 18 Resim 5. Kutanöz leishmaniasisin neden olduğu burun ve kulak lezyonları 54 Resim 6. Leishmania infantum’a bağlı distal uzuvlarda ülseratif lezyonlar 55 Resim 7. IFAT ile pozitif belirlenen örnekler 70 Resim 8. Leishmania spp.’ya ait RV primer çifti ile pozitif gelen örneklerin % 1,5 agaroz jel görüntüsü 72 Resim 9. Leishmania infantum’a ait MC primer çifti ile pozitif gelen örneğin % 1,5 agaroz jel görüntüsü 73 TABLOLAR DİZİNİ Tablo 1. Leishmaniasisin görülen formları ve etkenleri 7 Tablo 2. Leishmania sınıflandırılması 9 Tablo 3. Yeni ve Eski Dünya’da bulunan baskın türleri, vektörleri, rezervuarları ve yaptıkları hastalıklar 12 Tablo 4. Kum sineğinin sınıflandırılması 16 Tablo 5. Leishmaniasis tanı yöntemlerinin avantajları ve dezavantajları 28 Tablo 6. Örnek toplanan illerin kan ve serum örnek sayıları 64 Tablo 7. Kedilerden serum toplanan iller ve anti-Leishmania spp. IFAT sonuçları 69 Tablo 8. Kedilerden kan toplanan iller ve RV, MC primer ve Real-Time PZR sonuçları.7

Selection of genetic markers to determine diversity in Theileria annulata populations after recombination

Objective: Selecting polymorphic mini- and microsatellite markers to determine genetic diversity and chromosomal regions exhibiting elevated rates of recombination in Theileria annulata populations after recombination.   Methods: The Unipro UGENE software was used to select markers. A score at which 10 times more tandem repeats (TRs) were identified in the real DNA sequence than those in the scrambled sequences of T. annulata was used as the cutoff. TRs containing minimum three nucleotides in length for microsatellite and six nucleotides for minisatellite regions and having a repeat motif identity between 96%-100% with the unit size repeated minimum three times were screened through the whole genome using the suffix array algorithm.   Results: A total of 359 minisatellites and 8973 microsatellites were identified. TRs were screened one by one through the whole genome; mini- and microsatellites representing a single region and having suitable regions for primer design were selected based on their localization on T. annulata chromosomes, their repeat motif identity (>96%), and their repeat length (<1500 bp). The primers used to amplify selected candidates were designed, and each primer was used to check 27 different isolates of T. annulata.   Conclusion: In the present study, a total of 13 polymorphic mini- and microsatellite markers located on the different chromosomes were selected to determine the population diversity of T. annulata