Use of live attenuated mycobacteria for cancer treatment in experimental mouse models

Desde el trabajo de William Coley a finales del siglo XIX, quedó claro que los microorganismos vivos podían aprovecharse para el tratamiento del cáncer. Numerosos estudios preclínicos y ensayos clínicos durante el siglo XX condujeron a la aprobación de la vacuna viva para la tuberculosis, el Bacilo de Calmette-Guérin (BCG), para el tratamiento del cáncer de vejiga no músculo invasivo (CVNMI). Además, mediante el uso de modelos experimentales, quedó establecido que la actividad antitumoral de BCG se basa en la estimulación del sistema inmune.Aunque la terapia basada en la administración intravesical de BCG para el CVNMI es una de las inmunoterapias más exitosas hasta la fecha, presenta ciertas deficiencias. Una fracción importante de los pacientes no se beneficia de este tipo de terapia, y los efectos secundarios adversos pueden provocar la interrupción del tratamiento, lo que conduce a versiones modificadas con una eficacia terapéutica subóptima. Además, durante los últimos diez años ha habido una grave escasez de BCG a nivel mundial, lo que ha obligado al uso de otras aproximaciones terapéuticas o dosis reducidas de BCG. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar tratamientos alternativos para esta clase de pacientes. Dado el éxito de la terapia bacteriana en el campo del cáncer de vejiga, un conocimiento más profundo de su mecanismo de acción podría conducir a una mejora de este tipo de tratamiento.En la primera parte de este trabajo nos propusimos estudiar los factores bacterianos y asociados al huésped implicados en la eficacia antitumoral de las micobacterias vivas atenuadas para el cáncer de vejiga. Aprovechamos el hecho de que podíamos comparar directamente dos vacunas contra la tuberculosis distintas: BCG y MTBVAC. Mediante la comparación de su comportamiento en modelos experimentales de cáncer de vejiga en ratones, descubrimos que la capacidad de las bacterias para colonizar la vejiga estaba íntimamente relacionada con la eficacia del tratamiento. Es importante destacar que logramos identificar genes ausentes en BCG y presentes en MTBVAC que explicasen elmayor potencial terapéutico de esta última vacuna. Además, analizamos la respuesta inmune frente al tumor en la vejiga, mostrando que el tratamiento bacteriano intravesical era capaz de inducir respuestas dependientes de células T específicas del tumor. Por último, la eficacia terapéutica de MTBVAC intravesical en un modelo de cáncer de vejiga en ratón se vio claramente potenciada por la administración sistémica de anticuerpos bloqueantes del punto de control inmunitario PD-1/PD-L1.En la segunda parte de esta tesis, diseñamos una estrategia para localizar BCG en el pulmón con el objetivo de tratar tumores pulmonares primarios o metastásicos en modelos experimentales en el ratón. Se observó que la administración intravenosa de BCG en el ratón estimuló específicamente la respuesta inmunitaria antitumoral en el pulmón (tanto innata como adaptativa), que pudo potenciarse aún más mediante la inhibición del punto de control inmunitario PD-L1. Por lo tanto, con los resultados obtenidos en esta parte proponemos que el éxito de BCG en cáncer de vejiga y melanoma también podría aplicarse al campo de la oncología torácica.<br /

Caracterización de células mieloides inmunosupresoras en un modelo murino de tumorigénesis

En este trabajo nos enfocamos en la caracterización de las distintas subpoblaciones de MDSC en dos modelos murinos tumorigénicos donde se compararan en diferentes órganos con un modelo sano (control). Además, optimizamos ensayos de proliferación de esplenocitos para, posteriormente, estudiar la capacidad inmunosupresora de las MDSCs a través de cocultivos con bazos y tumores. Finalmente estudiamos si BCGpodría influir sobre ellas reeducando el sistema inmune editado por los tumores.<br /

Optimización de ensayos inmunológicos con células sanguíneas de ratón para evaluación de vacunas de tuberculosis

MTBVAC es una vacuna viva atenuada de Mycobacterium tuberculosis que actualmente se encuentra en ensayos clínicos. MTBVAC contiene los principales antígenos inmunodominantes de M. tuberculosis, ESAT6 y CFP10, los cuáles están ausentes en BCG. Recientemente se ha descrito que ESAT6 y CFP10 podrían estar implicados en la mayor eficacia de MTBVAC respecto a BCG. En este trabajo, se llevó a cabo la caracterización molecular de distintas cepas de MTBVAC para dilucidar el papel de CFP10 en la protección mediada por MTBVAC. Sin embargo, las cepas utilizadas no mostraron complementación de CFP10 impidiendo continuar con los estudios.Por otro lado, los métodos actuales de diagnóstico de TB conocidos como IGRA utilizan antígenos presentes en MTBVAC lo que dificulta la diferenciación entre vacunados con MTBVAC e infectados por M. tuberculosis ya que ambos casos generan respuesta contra estos antígenos. En este trabajo, se ha llevado a cabo la optimización de un ensayo tipo EliSPOT que permite evaluar la respuesta específica de MTBVAC en sangre de ratón utilizando los antígenos ESAT6, CFP10 y EspC.<br /

Use of live attenuated Mycobacteria as treatment against asthma and their ability to induce trained immunity

El asma es la enfermedad inflamatoria más común de los pulmones. Su incidencia alcanza el 12% en los países desarrollados, mientras que en los países en vías de desarrollo es del 1%. Por lo tanto, el gasto económico que el asma acarrea es muy alto, además los actuales tratamientos están dirigidos a paliar los síntomas y no perduran en el tiempo. En este sentido, se ha postulado que la respuesta Th1 que desencadenan las micobacterias podría suprimir la exacerbación de la respuesta Th2 que prima en el asma alérgico, y por tanto, estas bacterias podrían usarse como un tratamiento más eficaz.Por un lado, la tuberculosis en humanos se ha asociado con un descenso en la tasa de asma. En relación a esto, hemos demostrado por primera vez que la infección con Mycobacterium tuberculosis previene el asma alérgico en modelo de ratón. Este efecto protector implica una reducción en la producción de eosinófilos en la médula ósea y en su infiltración a las vías respiratorias. Además, la infección también produce una disminución de la respuesta Th2, a través de la inducción de la respuesta Th1.Por otro lado, ya existen datos en la literatura sobre el uso de BCG frente al asma, pero los resultados no son concluyentes y la vacuna sólo se ha probado como tratamiento preventivo. En este trabajo, hemos evaluado el uso de BCG y MTBVAC frente al asma alérgica en ratones. MTBVAC es la única vacuna viva atenuada a partir de M. tuberculosis que entra en ensayos clínicos, donde ha demostrado ser segura e inmunogénica, por lo tanto está llamada a remplazar a BCG, si demuestra una mayor protección contra las formas respiratorias de tuberculosis. Hemos demostrado que tanto BCG como MTBVAC son efectivas como tratamiento preventivo frente al asma alérgica. Aún más importante, hemos probado por primera vez que ejercen un papel terapéutico frente al asma ya establecida, al administrarse por la vía intranasal, y que este efecto es similar entre ambas vacunas. Los efectos beneficiosos de MTBVAC y BCG incluyen la supresión de la eosinofilia en las vías aéreas, la disminución de la producción de citoquinas tipo Th2 y de las células Th2, y una menor remodelación de las vías aéreas. Este efecto terapéutico tiene gran relevancia clínica, ya que los pacientes asmáticos podrían tratarse con micobacterias atenuadas usando un nebulizador. Además, demostramos que la acción frente al asma mediada por ambas vacunas se basa en la disfunción de la respuesta Th2, a través de la inducción de la respuesta Th1, y en la re polarización de los macrófagos M2 a macrófagos M1. La respuesta anti-asma es dosis dependiente, y parece requerir del contacto entre la bacteria y las células inmunes del pulmón.También es importante el hecho de que MTBVAC y BCG reducen los eosinófilos en los esófagos de ratones, por lo que planteamos la hipótesis de que estas bacterias puedan usarse como tratamiento frente a la esofagitis eosinofílica o frente a otras alergias alimentarias. Recientemente, se ha descubierto que el sistema inmune innato en humanos es capaz de responder más fuerte y eficientemente frente a un segundo estímulo, de forma inespecífica. Esta capacidad se ha descrito con el término “trained immunity” o inmunidad entrenada. Además, se ha demostrado que BCG es capaz de inducir estos rasgos de memoria en las células innatas, tanto in vitro como in vivo. Gracias a esto, BCG es capaz de mediar efectos inespecíficos beneficiosos frente a algunas enfermedades, como podrían ser el cáncer de vejiga o ciertas enfermedades respiratorias.En este trabajo hemos demostrado que MTBVAC es capaz de inducir “trained immunity” in vitro en monocitos humanos, y también in vivo en ratones. Además, la potencia de esta respuesta alcanza valores similares a los obtenidos con BCG. Demostramos que los monocitos entrenados por MTBVAC exhiben cambios en el metabolismo, como son el aumento en la tasa glicolítica y la dependencia de la ruta de la glutaminólisis. La vacuna también induce cambios epigenéticos a través del enriquecimiento de la marca H3K4me3 (asociada a la activación de la transcripción) en la región del promotor de los genes TNFA e IL6, lo que correlaciona con el aumento en la potencia de la respuesta inmune innata que ocurre tras la reinfección. Como conclusión, los resultados obtenidos abalan el estudio clínico de MTBVAC como terapia frente al asma, y apoyan su progresión en los ensayos clínicos contra la tuberculosis como vacuna administrada al nacimiento, ya que podría ejercer los mismos beneficios inespecíficos que presenta BCG.<br /

Role of PknH in Mycobacterium tuberculosis Complex virulence. Involvement of lung myeloid cells in vaccine-induced protection of pulmonary delivered BCG

La tuberculosis es actualmente la enfermedad infecciosa asociada a un único patógeno más devastadora, causando alrededor de 1.5 millones de muertes en 2018. A pesar de la existencia de la vacuna BCG y su amplia administración, su protección variable contra las formas respiratorias de la enfermedad junto con la creciente aparición de cepas resistentes a los antibióticos, convierte a la tuberculosis en un alarmante problema de salud global. La tuberculosis es causada en mamíferos por organismos del complejo de Mycobacterium tuberculosis (MTBC), cuyos genomas presentan más del 99% de homología. Sin embargo, los miembros del MTBC muestran importantes diferencias en cuanto a especificidad de huésped y virulencia. Mycobacterium tuberculosis es el principal agente causal de la tuberculosis en humanos, mientras que otros miembros del MTBC causan tuberculosis en un amplio rango de mamíferos, como Mycobacterium bovis, el principal agente causal de la tuberculosis bovina. La tuberculosis bovina provoca importantes pérdidas económicas a nivel global asociadas al control de la enfermedad y a pérdidas de producción, tanto en países desarrollados como en países en vías de desarrollo. Además, la infección zoonótica causada por M. bovis representa una amenaza para la salud humana. A pesar de su alto grado de homología genómica, M. tuberculosis y M. bovis presentan importantes diferencias fenotípicas. M. bovis ha demostrado ser más virulenta que M. tuberculosis en diferentes modelos animales, y aunque M. tuberculosis no produce enfermedad en el ganado, M. bovis presenta un amplio rango de hospedadores, que incluye diferentes animales mamíferos salvajes y domesticados, así como el ser humano. En este trabajo, hemos caracterizado la infección de diferentes miembros del MTBC en modelo de ratón con el objetivo de definir sus diferencias de virulencia in vivo. Se ha observado que M. bovis presenta mayor virulencia que M. tuberculosis y M. africanum, al inducir mayor patología pulmonar y presentar mayor capacidad de diseminación, así como mayor grado de infectividad en pulmón y mayor infiltración de neutrófilos pulmonares. Sin embargo, a pesar de las diferencias de infección observadas entre M. bovis y M. tuberculosis, los mecanismos genéticos y moleculares responsables de las diferencias en virulencia y especificidad de huésped no son conocidos. La PknH es una serina/treonina quinasa implicada en la regulación de diversos procesos bacterianos en M. tuberculosis que, además, ha sido relacionada con virulencia. La organización genética de la región del genoma que contiene el gen de la pknH (región RD900) presenta gran variación a lo largo de los miembros del MTBC, entre los que se encuentran M. tuberculosis y M. bovis. Con el objetivo de estudiar las consecuencias de estas variaciones, hemos analizado la organización genética de la región RD900 y de los genes pknH en el contexto evolutivo del MTBC, demostrando la existencia de deleciones independientes de la región RD900 en diferentes linajes del MTBC y en diferentes cepas del mismo linaje. Además, se ha observado una deleción en una región correspondiente a un dominio rico en prolinas en el gen de la pknH conservada en M. bovis y M. caprae respecto al resto de especies del MTBC. El posible papel diferencial de la PknH en la regulación de la virulencia de M. bovis como consecuencia de estas variaciones ha sido evaluado mediante la construcción y caracterización de cepas mutantes de la PknH de M. bovis y M. tuberculosis. La inserción de la PknH de M. tuberculosis en el genoma de cepas de M. bovis dio lugar a una reducción de la virulencia de las cepas mutantes respecto a las cepas silvestres de M. bovis. Además, los perfiles de expresión génica de estas cepas mostraron diferencias en la expresión de un amplio conjunto de genes, lo que sugiere un posible papel diferencial de la PknH en la regulación de la virulencia de M. tuberculosis y M. bovis. La falta de eficacia de BCG en la protección contra la tuberculosis pulmonar convierte el desarrollo de nuevas estrategias de vacunación efectivas en una necesidad urgente. El uso de rutas alternativas de vacunación para la administración de BCG o de nuevos candidatos a vacuna ha cobrado un renovado interés durante los últimos años. Una de las rutas alternativas de administración más estudiadas es la ruta pulmonar, cuyo objetivo es mimetizar la vía natural de infección de M. tuberculosis. Diversos estudios preclínicos en diferentes modelos animales han demostrado que la vacunación pulmonar con BCG confiere mejor protección que la vacunación por vía subcutánea o intradérmica. Sin embargo, los estudios de la respuesta inmune inducida por la vacunación pulmonar con BCG realizados hasta el momento están centrados en el estudio de respuestas adaptativas, pero existen pocos datos de la inmunidad innata local y de la interacción de BCG con las células mieloides del pulmón. En este trabajo, hemos administrado micobacterias virulentas y atenuadas que expresan GFP por vía pulmonar, con el objetivo de caracterizar in vivo las poblaciones de células mieloides infectadas en el pulmón y las diferencias en la dinámica de infección en modelo de ratón, observándose grandes diferencias en los patrones de diseminación de M. tuberculosis y BCG. Mientras que BCG permanece principalmente en los macrófagos, M. tuberculosis disemina de forma activa de macrófagos a neutrófilos en un mecanismo dependiente de RD1. La presencia de BCG en los pulmones da lugar a la activación de los macrófagos del pulmón. Como consecuencia, la replicación y diseminación a neutrófilos de M. tuberculosis queda restringida cuando el patógeno es fagocitado por macrófagos pre-activados en ratones previamente vacunados con BCG por vía pulmonar, pero no subcutánea, lo que correlaciona con un elevado nivel de protección. Además, se ha demostrado que el mecanismo de activación de los macrófagos pulmonares inducido por BCG requiere la contribución de las células T CD4 para su generación, pero no para su mantenimiento. De forma relevante, la vacunación pulmonar con BCG induce la activación a largo plazo de los macrófagos alveolares, los cuales mantienen su estatus de activación y capacidad bactericida durante largo tiempo una vez que la vacuna ha sido eliminada del pulmón, lo que sugiere la generación de rasgos de memoria en los macrófagos pulmonares. Estos resultados destacan la gran importancia de la dinámica celular de infección para el éxito de la infección temprana con M. tuberculosis y sugieren que los macrófagos del pulmón contribuyen de manera crucial a la protección temprana contra la tuberculosis inducida por vacunas vivas administradas por vía pulmonar.Tuberculosis (TB) is nowadays the most devastating infectious disease associated with a single pathogen. Despite the existence of the widely administered BCG vaccine, its variable protection against pulmonary TB along with the rising appearance of drug resistant strains makes this disease an alarming global health problem, causing an estimated 1.5 million deaths in 2018. TB is caused in humans and animals by organisms from the Mycobacterium tuberculosis Complex (MTBC), that show more than 99% genetic identity but exhibit distinct host preference and virulence. Unlike the human restriction of M. tuberculosis, Mycobacterium bovis, the causative agent of bovine TB, has one of the broadest host ranges of all known pathogens and exacts a global tremendous economic burden in both developed and developing countries. Although it mainly infects cattle, M. bovis exhibits transmissibility across many other mammalian species and it has been found to be more virulent than M. tuberculosis in different animal models. However, the molecular genetic changes that underly host specificity and infection phenotype within MTBC members have not been fully elucidated. In this work, we performed a comparison study between M. tuberculosis, M. bovis and M. africanum strains regarding their virulence and dissemination ability in vivo. In addition, we analysed RD900 genomic region across MTBC members using whole genome sequences from different MTBC strains so as to determine its role in the context of MTBC evolutionary history. The RD900 region comprises two homologous genes encoding the serine/threonine protein kinase PknH flanking the tbd2 gene. PknH is involved in the regulation of several bacterial processes and has been associated with virulence in M. tuberculosis. This analysis revealed that RD900 has been independently lost in different MTBC lineages and different strains, resulting in the generation of a single pknH gene. Importantly, all the analysed M. bovis and M. caprae strains carry a conserved deletion within a proline rich-region of pknH genes independent of RD900 presence or absence. We hypothesized that conservation of this deletion in M. bovis may affect PknH function, having a potential role in its virulence and evolutionary adaptation. To explore this hypothesis, we constructed and characterized M. bovis and M. tuberculosis pknH mutant strains. M. bovis knock-in strains containing the M. tuberculosis complete pknH gene revealed a reduced virulence compared to the wild type in the mouse model, suggesting that PknH plays an important role in the differential virulence phenotype of M. bovis vs M. tuberculosis. The failure of BCG to protect against pulmonary TB results in an urgent need for the development of new effective TB vaccines strategies. The use of alternative routes of administration for the delivery of BCG or new vaccine candidates has emerged a renewed interest during the last years. One of the most studied non-canonical routes of administration is the pulmonary delivery, with the rationale of mimicking the natural route of M. tuberculosis infection. In this regard, preclinical studies in different animal models have shown that pulmonary BCG confers significantly improved protection compared to subcutaneous or intradermal vaccination. However, current immunogenicity studies about mucosal immune responses elicited by pulmonary BCG are focused on adaptive responses, with few data of local innate immunity and BCG interaction with lung myeloid cells. In the present study, we pulmonary delivered GFP-expressing virulent and attenuated mycobacteria to characterize infected lung myeloid populations and differences in cellular infection dynamics occurring in vivo in the mouse model. We found profound differences in dissemination patterns between M. tuberculosis and BCG. Whereas BCG mainly remained in the macrophage compartment, M. tuberculosis actively spread from macrophages to neutrophils in a mechanism dependent on RD1-containg genes. BCG presence in lungs leads to the activation of lung macrophages. As a consequence, M. tuberculosis replication and neutrophil dissemination is impaired when M. tuberculosis is engulfed by BCG pre-activated macrophages in pulmonary, but not subcutaneous, vaccinated mice, which correlates with a strong vaccine-induced protection. Furthermore, we show that lung macrophages are activated by pulmonary BCG in a mechanism that required the contribution of CD4 T cells for the induction, but not maintenance, of their activation status. Noteworthy, pulmonary BCG induced long-term activation of alveolar macrophages, which maintain their activation status and early bactericidal capacity long after vaccine clearance, suggesting the generation of a memory-like response in lung macrophages. These results highlight a crucial importance of bacterial cell-to-cell infection dynamics for early M. tuberculosis infection success, and indicate that lung macrophages might crucially contribute to the early protection provided by pulmonary live TB vaccines. <br /

Estudio del tráfico intracelular y presentación antigénica de la vacuna MTBVAC en macrófagos

La falta de eficacia de la actual vacuna contra la tuberculosis, el bacilo de Calmette-Guérin o BCG, en proteger contra las formas respiratorias de la enfermedad y responsables de su transmisión, hace necesario el desarrollo de nuevas vacunas más eficaces que permitan reducir la incidencia de la tuberculosis, principalmente en países subdesarrollados. El nuevo candidato a vacuna contra la tuberculosis –MTBVAC-, desarrollado en la Universidad de Zaragoza a partir de la atenuación de un asilado clínico de Mycobacterium tuberculosis, es la primera vacuna viva atenuada basada en M. tuberculosis en entrar en ensayos clínicos humanos, donde ha demostrado un alto grado de seguridad. Para el progreso de MTBVAC hacia ensayos clínicos de eficacia resulta crucial el conocimiento de los mecanismos inmunológicos que le confieren mayor protección respecto a BCG, y que permitan el desarrollo de biomarcadores asociados a la protección de la vacuna. El objetivo del presente trabajo es el estudio comparativo del tráfico intracelular de BCG y MTBVAC en macrófagos de ratón, y de cómo estas diferencias afectan a su capacidad para inducir una presentación antigénica eficaz que pueda correlacionarse con la diferente protección e inmunogenicidad in vivo de ambas vacunas. El trabajo realizado se basa en el estudio del tráfico intracelular y la presentación antigénica en macrófagos derivados de médula ósea de ratón infectados con BCG o MTBVAC. En ellos se ha estudiado la colocalización de las bacterias en compartimentos ácidos mediante microscopía confocal, y su capacidad de activar a las células que infectan a través del análisis de la expresión de distintos marcadores de superficie mediante citometría de flujo. Finalmente, se ha optimizado un ensayo para estudiar la presentación antigénica de BCG y MTBVAC a través de la utilización de hibridomas T que reconocen específicamente un péptido inmunogénico derivado del antígeno mayor de M. tuberculosis Ag85B

Estudio de rutas de vacunación en modelo murino para el uso profiláctico o terapéutico de vacunas atenuadas de tuberculosis

La tuberculosis es una de las enfermedades infecciosas que produce mayor mortalidad en el mundo. El agente causante es Mycobacterium tuberculosis que convive estrechamente con el hombre desde sus inicios como Homo sapiens. De momento, la única vacuna disponible es BCG (derivada de Mycobacterium bovis) pero esta no es efectiva contra la tuberculosis pulmonar en adultos, que es además la forma responsable de la transmisión de la enfermedad. Actualmente muchos equipos de investigación están trabajando en el desarrollo de nuevas vacunas y tratamientos eficaces, siendo MTBVAC la única vacuna candidata basada en la atenuación del agente patógeno causante de la tuberculosis humana. La eficacia de esta vacuna está siendo actualmente estudiada en ensayos clínicos en Fase III de eficacia. Previo a la fase clínica todos los estudios conllevan una fase de estudios preclínicos in vitro y después en animales de experimentación. El modelo murino es el modelo de elección en animales de experimentación, principalmente por su facilidad de manejo, economía de estabulado y disponibilidad de reactivos específicos de ratón para estudios inmunológicos. En esta tesis relacionamos distintos modelos de experimentación en ratones para lo cual hemos seleccionado 4 estudios de investigación basados en las vacunas vivas atenuadas MTBVAC y BCG. <br /

Utilización del candidato a vacuna contra la tuberculosis como vector de expresión de Granzima B

La actual vacuna contra la tuberculosis, el bacilo de Calmette-Guérin o BCG, es una vacuna viva atenuada derivada de una cepa de M. bovis, y constituye también el tratamiento inmunoterápico de primera línea contra el carcinoma de vejiga. BCG se ha mostrado además como un candidato adecuado para el desarrollo de vacunas recombinantes que permitan la expresión simultánea de múltiples antígenos protectores de diferentes patógenos, habiendo conseguido con éxito la expresión de diversas proteínas recombinantes. El nuevo candidato a vacuna contra la tuberculosis –MTBVAC-, creado en la Universidad de Zaragoza, y producido por la empresa biotecnológica Biofabri, ha sido la primera vacuna viva atenuada basada en M. tuberculosis en entrar en fases de ensayos clínicos. En este contexto, el objetivo del presente trabajo consiste en la utilización de MTBVAC y BCG como vectores de expresión de granzima B, proteína conocida por su papel iniciador en el proceso de apoptosis. Se espera que las vacunas recombinantes BCG o MTVAC que expresen granzima B sean capaces de inducir apoptosis de forma eficaz en las células tumorales que infectan, mejorando su eficacia frente al tratamiento del cáncer de vejiga. El trabajo realizado se basa en la caracterización de la expresión, secreción y funcionalidad de la granzima B clonada en cepas de BCG y MTBVAC en su forma activa e inactiva. En ellas se ha caracterizado la expresión de la proteína desde la transcripción del gen codificante de la granzima B a través de extracción de RNA y PCR cuantitativa real time, hasta la expresión proteica mediante técnicas de extracción de proteína y análisis por Western blot. Finalmente se ha analizado la actividad de la granzima B recombinante secretada a través de un ensayo enzimático de actividad