Comparative analysis of the molecular mechanisms that regulate the biological and clinical behavior of DLBCL with respect to differentiation, apoptosis, proliferation, angiogenesis and chromosomal stubility.

The aim of the present study was to analyze the molecular mechanisms that regulate the biological behavior of DLBCL with respect to apoptosis, proliferation, angiogenesis and chromosomal stubility, and to analyse the relations between differentiation immunophenotypes, apoptosis and proliferation in DLBCL. METHODOLOGY In the present study 79 cases De novo DLBCL were analyzed for the immunohistochemical expression of Bcl6 and CD10 proteins in relation to the apoptotic index and the major proliferation and apoptosis associated proteins. Furthermore, we analyzed the levels of expression of Bcl-6, Bcl-2 and BclXL by means of immunoblotting and densitometry. We also examined 19 specimens using interphase fluorescence in situ hybridization to evaluate the Bcl-2 gene rearrangements. Finally, we examined the immunohistochemical expression of VEGF protein. RESULTS-COCLUSIONS Our findings indicate that increased expression of the Bcl6 and CD10 proteins is associated with increased apoptosis and proliferation. Moreover, significant correlation was found between increased apoptotic index and the Bcl6+/CD10+ pattern. Also two major differentiation immunophenotypic profiles were distinguished: the germinal center B-cell-like profile and the non-germinal center B-cell-like profile. The above findings indicate that DLBCLs with germinal center immunophenotypic profile are associated with increased apoptosis, high expression of the pro-apoptotic proteins and low expression of the anti-apoptotic proteins. Therefore it could be hypothesized that germinal center B-cell-like DLBCL may be more susceptible to apoptosis and thus more sensitive to treatment SDS page analysis revealed that the extraction procedure we describe achieves in extracting intact molecules from paraffin embedded tissues. Densitometry analysis revealed that the immunohistochemical results are in agreement with the quantitative analysis. Further results confirmed the findings of previous reports indicating that t(14;18) is found in DLBCL specimens exhibiting a ‘‘GCB phenotype’’ and is associated with increased expression of Bcl-2 protein. An additional chromosome 18 and/or Bcl-2 gene amplification were associated with a ‘‘non-GCB phenotype’’ and high expression of Bcl-2 protein. Our results show that DLBCL specimens with Bcl-2 overexpression can be divided into at least two heterogeneous groups. In the present study we found that the eexpression status of VEGF did not show any significant correlations.Σκοπός αυτής της μελέτης ήταν η περαιτέρω διερεύνηση των μηχανισμών παθογένεσης των DLBCL μέσω συνδυασμένης ανάλυσης του ιστογενετικού φαινότυπου, του κυτταρικού κύκλου, της απόπτωσης, της αγγειογένεσης, και των κυτταρογενετικών ανωμαλιών σε σχέση με την ιστογενετική προέλευση των DLBCL. ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΊΑ Στην παρούσα εργασία μελετήθηκαν 79 περιπτώσεις πρωτοπαθών DLBCL για την ανοσοιστοχημική έκφραση των πρωτεϊνών CD10, Bcl-6, MUM1, CD138, Bcl-2, Bcl-XL, Bax, Bak, Bad, Bid και VEGF. Επιπλέον μελετήθηκε ο αποπτωτικός δείκτης με τη μέθοδο TUNEL και οι πιθανές αριθμητικές ανωμαλίες και η διαμετάθεση του γονιδίου Bcl-2 (t(14;18)) με τη μέθοδο FISH. Οι πρωτεΐνες Β-κυτταρικής διαφοροποίησης καθώς και οι αποπτωτικές πρωτεΐνες μελετήθηκαν και με την μέθοδο της ανοσοαποτύπωσης κατά Western. Τα αποτελέσματα των παραπάνω αναλύσεων συσχετίστηκαν με τον δείκτη πολλαπλασιασμού (Ki67/MIB1) και πρωτεΐνες που ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο. ΑΠΟΤΕΛΈΣΜΑΤΑ - ΣΥΜΠΕΡΆΣΜΑΤΑ Τα ευρήματα της παρούσας μελέτης ενισχύουν την άποψη ότι η έκφραση των πρωτεϊνών Bcl-6 και CD10 συσχετίζεται με ευνοϊκή κλινική πορεία των ασθενών με DLBCL και θα μπορούσε κανείς να υποθέσει ότι οι Bcl-6 και οι CD10-θετικές περιπτώσεις είναι περισσότερο ευαίσθητες στην απόπτωση και επομένως ανταποκρίνονται καλύτερα στην χημειοθεραπεία. Επίσης, η παρούσα μελέτη έδειξε ότι τα GCΒ-DLBCL σχετίζονται με αυξημένη απόπτωση, υψηλή έκφραση προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών και χαμηλή έκφραση της αντί-αποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-XL. Αντίθετα τα nonGC-DLBCL συσχετίζονται με ελαττωμένη απόπτωση, χαμηλή έκφραση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών Bax, Bak, και Bid και υψηλή έκφραση της αντί-αποπτωτικής πρωτεΐνης Bcl-XL. Δεδομένου ότι προηγούμενες κλινικές μελέτες έδειξαν ότι τα GCB-DLBCL εμφανίζουν ευνοϊκή κλινική πορεία θα μπορούσε κανείς να υποθέσει ότι τα GCB-DLBCL είναι περισσότερο ευαίσθητα στην απόπτωση και επομένως περισσότερο ευαίσθητα στη θεραπεία. Επίσης, στην παρούσα μελέτη επιβεβαιώθηκε η δυνατότητα χρήσης αρχειακού παθολογικοανατομικού υλικού και ανάκτησης ακέραιων πρωτεϊνικών μορίων με σκοπό την άμεση ποσοτικοποίηση τους μέσω ανοσοαποτύπωση κατά Western . Επιπλέον, στην παρούσα μελέτη βρέθηκε ότι όλες οι περιπτώσεις με διαμετάθεση του γονιδίου Bcl-2 ανήκαν στον ιστογενετικό υπότυπο του GCB-DLBC γεγονός το οποίο δείχνει ότι η διαμετάθεση t(14;18) παίζει σημαντικό ρόλο στην παθογένεση του GCB-DLBC. Στην παρούσα μελέτη δεν ανευρέθηκαν στατιστικώς σημαντικές διαφορές στην έκφραση της πρωτεΐνης VEGF