Chromatin in fractal globule state: evidence from comet assay

At higher order levels chromatin is organized into loops that appear as a result of contacts between distant loci. The aim of this work was to investigate the length distribution of the DNA loops in nucleoids obtained after lysis of either whole cells or isolated cell nuclei. Methods. We used single cell gel electrophoresis to analyze the kinetics of the DNA loop migration from the two nucleoid types. Results. The kinetics of the DNA exit was found to have specific features for the two types of nucleoids. At the same time, in both cases, the DNA amount in the electrophoretic track depends linearly on the length of the longest loops in the track. Conclusions. We have concluded that for the loops up to ~ 100 kb the length distribution appears to be consistent with the fractal globule organization.В інтерфазному ядрі хроматин організований у вигляді петельних доменів, що виникають у результаті контактів між віддаленими локусами. Мета роботи полягала у дослідженні розподілу за довжиною петельних доменів ДНК у нуклеоїдах, отриманих шляхом лізису клітин або ізольованих ядер. Методи. Ми застосовували метод електрофорезу ДНК ізольованих клітин для аналізу кінетики міграції петель ДНК із двох типів нуклеоїдів. Результати. Кінетичні криві, що описують вихід ДНК із двох типів нуклеоїдів, відрізнялися декількома особливостями. У той самий час, в обох випадках кількість ДНК в електрофоретичному треку лінійно залежить від розміру найдовших петель у ньому. Висновки. Отримані результати свідчать, що для петель до ~100 kb їхній розподіл за довжиною узгоджуються зі структурою фра­ктальної глобули.В интерфазном ядре хроматин организован в виде петельных доменов, возникающих в результате контактов между отдаленными локусами. Цель работы заключалась в исследовании распределения по длине петельных доменов ДНК в нуклеоидах, полученных путем лизиса клеток или изолированных ядер. Методы. Мы использовали электрофорез ДНК изолированных клеток для анализа кинетики миграции петель ДНК из двух типов нуклеоидов. Результаты. Кинетические кривые, описывающие выход ДНК из двух типов нуклеоидов, отличались рядом особенностей. В то же время, в обоих случаях количество ДНК в электрофоретическом треке линейно зависит от длины наибольших петель в нем. Выводы. Полученные результаты указывают, что для петель до ~ 100 kb их распределение по длине согласуется со структурой фрактальной глобулы

DNA loop organization in glioblastoma T98G cells at their different functional states

The loop domain organization of chromatin, which plays an important role in transcription regulation, may depend on the cell functional state. Aim. To investigate DNA loop reorganization upon functional transitions in the glioblastoma T98G cells. Methods. Single cell gel electrophoresis (a comet assay) was used to analyze the kinetics of the DNA loop migration from the nucleoids obtained from the lysed cells. Results. The cells arrested in the G1 phase of the cell cycle were characterized by a relatively low amount of DNA in the comet tails due to a low content of DNA in the loops which may be resolved by the comet assay (up to ~300 kb). After cell reactivation, the contour length of the loops essentially increased in parallel with a decrease in the linear loop density along the genome. Conclusions. An increase in the loop size and a respective decrease in the loop density may be a general feature of activated cells as we earlier observed similar effects upon activation of human lymphocytes.Організація петельних доменів хроматину, яка відіграє важливу роль у регуляції транскрипції, напевно може залежати від функціонального стану клітини. Мета. Дослідити можливу реорганізацію петель ДНК при функціональних переходах у гліобластомних клітинах T98G. Методи. Ми застосовували метод електрофорезу ДНК ізольованих клітин (кометний електрофорез) для аналізу кінетики міграції петель ДНК з нуклеоїдів, отриманих з лізованих клітин. Результати. Клітини, заарештовані на фазі G1 клітинного циклу, характеризуються порівняно низьким вмістом ДНК у хвостах комет внаслідок низького вмісту ДНК у складі петель, що знаходяться у межах роздільної здатності кометного електрофорезу (до ~300 кб). Після реактивації клітин контурна довжина петель суттєво зростає, паралельно зі зниженням лінійної щільності петель уздовж геному. Висновки. Оскільки подібні ефекти спостерігались нами раніше для активованих лімфоцитів, ми робимо висновок, що зростання розміру петель та відповідне зниження їхньої лінійної щільності може бути загальною характеристикою активованих клітин.Организация петельных доменов хроматина, играющая важную роль в регуляции транскрипции, предположительно может зависеть от функционального состояния клетки. Цель. Исследовать возможной реорганизации петель ДНК при функциональных переходах в глиобластомных клетках T98G. Методы. Мы использовали электрофорез ДНК изолированных клеток (кометный электрофорез) для анализа кинетики миграции петель ДНК из нуклеоидов, полученных из лизированных клеток. Результаты. Клетки, арестованные на фазе G1 клеточного цикла, характеризуются сравнительно низким содержанием ДНК в хвостах комет из-за низкого содержания ДНК в составе петель, которые находятся в пределах разрешающей способности кометного электрофореза (до ~300 кб). После реактивации клеток контурная длина петель существенно возрастает, параллельно со снижением линейной плотности петель вдоль генома. Выводы. Поскольку аналогичные эффекты наблюдались нами ранее для активированных лимфоцитов, мы заключили, что возрастание размера петель и соответствующее снижение их линейной плотности может быть общей характеристикой активированных клеток

Influence of chloroquine on kinetics of single-cell gel electrophoresis

In single-cell gel electrophoresis (the comet assay) the DNA of lysed cells, the nucleoids, extends towards the anode in a track resembling a comet tail. The aim of this work was to investigate the effects of changes in DNA topology on this process. Methods. We used the kinetic approach, proposed earlier by us, to measure a relative amount of DNA in the comet tails as a function of time in the presence of different concentrations of chloroquine, a widely used intercalator. Results. We have shown that, at given small concentrations, intercalation of chloroquine strongly facilitates the comet tail formation. At the same time, some part of DNA (about 8 %) in the nucleoids exits very fast independently on chloroquine, while the largest part of DNA (about three quarters) does not exit at all. At high concentrations the intercalator increases the fraction of DNA, which cannot exit. Conclusions. Our results imply that the loop domains, which contain about one to several hundreds kilobases, represent only a small part (about a quarter) of DNA in the nucleus. The intercalation induces detachment of these loops from the nuclear matrix. Keywords: comet assay, chloroquine, intercalation, DNA loops, supercoiling.При електрофорезі ізольованих клітин (кометному електрофорезі) ДНК виходить з лізованих клітин (нуклеоїдів) у напрямку до аноду, утворюючи трек, що нагадує хвіст комети. Мета роботи полягала у вивченні впливу топологічних змін у ДНК на цей процес. Методи. Використано запропонований нами раніше кінетичний підхід для вимірювання відносного вмісту ДНК у хвостах комет залежно від часу за присутності різних концентрацій хлорокіну – одного з відомих інтеркаляторів. Результати. Показано, що за певних низьких концентрацій інтеркаляція хлорокіну суттєво прискорює формування хвостів комет. З іншого боку, невелика кількість ДНК нуклеоїдів (близько 8 %) виходить дуже швидко незалежно від хлорокіну, тоді як більша частина (приблизно три чверті) – не виходить взагалі. За високих концентрацій інтеркалятора зростає ця нездатна до виходу частина ДНК. Висновки. Одержані результати вказують на те, що петельні домени, які містять від однієї до кількох сотень пар основ, представляють лише малу частину (близько чверті) усієї ДНК нуклеоїда. Інтеркаляція спричиняє від’єднання цих петель від ядерного матриксу. Ключові слова: кометний електрофорез, хлорокін, інтеркаляція, петлі ДНК, надспіралізація.При электрофорезе изолированных клеток (кометном электрофорезе) ДНК выходит из лизированных клеток (нуклеоидов) в направлении анода, формируя трек, напоминающий хвост кометы. Цель работы состояла в изучении влияния топологических изменений в ДНК на этот процесс. Методы. Использован предложенный нами ранее кинетический подход для измерения относительного содержания ДНК в хвостах комет в зависимости от времени в присутствии различных концентраций хлорокина – одного из известных интеркаляторов. Результаты. Показано, что при определенных низких концентрациях интеркаляция хлорокина существенно ускоряет формирование хвостов комет. С другой стороны, небольшое количество ДНК нуклеоидов (около 8 %) выходит очень быстро независимо от хлорокина, тогда как большая часть (приблизительно три четверти) – не выходит вообще. При высоких концентрациях интеркалятора увеличивается эта неспособная к выходу часть ДНК. Выводы. Наши результаты указывают на то, что петельные домены, содержащие от одной до нескольких сотен пар нуклеотидов, составляют только малую часть (около четверти) всей ДНК нуклеоида. Интеркаляция вызывает отсоединение этих петель от ядерного матрикса. Ключевые слова: кометный электрофорез, хлорокин, интеркаляция, петли ДНК, сверхспирализация

Chromatin in fractal globule state: evidence from comet assay

At higher order levels chromatin is organized into loops that appear as a result of contacts between distant loci. The aim of this work was to investigate the length distribution of the DNA loops in nucleoids obtained after lysis of either whole cells or isolated cell nuclei. Methods. We used single cell gel electrophoresis to analyze the kinetics of the DNA loop migration from the two nucleoid types. Results. The kinetics of the DNA exit was found to have specific features for the two types of nucleoids. At the same time, in both cases, the DNA amount in the electrophoretic track depends linearly on the length of the longest loops in the track. Conclusions. We have concluded that for the loops up to ~ 100 kb the length distribution appears to be consistent with the fractal globule organization.В інтерфазному ядрі хроматин організований у вигляді петельних доменів, що виникають у результаті контактів між віддаленими локусами. Мета роботи полягала у дослідженні розподілу за довжиною петельних доменів ДНК у нуклеоїдах, отриманих шляхом лізису клітин або ізольованих ядер. Методи. Ми застосовували метод електрофорезу ДНК ізольованих клітин для аналізу кінетики міграції петель ДНК із двох типів нуклеоїдів. Результати. Кінетичні криві, що описують вихід ДНК із двох типів нуклеоїдів, відрізнялися декількома особливостями. У той самий час, в обох випадках кількість ДНК в електрофоретичному треку лінійно залежить від розміру найдовших петель у ньому. Висновки. Отримані результати свідчать, що для петель до ~100 kb їхній розподіл за довжиною узгоджуються зі структурою фра­ктальної глобули.В интерфазном ядре хроматин организован в виде петельных доменов, возникающих в результате контактов между отдаленными локусами. Цель работы заключалась в исследовании распределения по длине петельных доменов ДНК в нуклеоидах, полученных путем лизиса клеток или изолированных ядер. Методы. Мы использовали электрофорез ДНК изолированных клеток для анализа кинетики миграции петель ДНК из двух типов нуклеоидов. Результаты. Кинетические кривые, описывающие выход ДНК из двух типов нуклеоидов, отличались рядом особенностей. В то же время, в обоих случаях количество ДНК в электрофоретическом треке линейно зависит от длины наибольших петель в нем. Выводы. Полученные результаты указывают, что для петель до ~ 100 kb их распределение по длине согласуется со структурой фрактальной глобулы

Influence of chloroquine on kinetics of single-cell gel electrophoresis

In single-cell gel electrophoresis (the comet assay) the DNA of lysed cells, the nucleoids, extends towards the anode in a track resembling a comet tail. The aim of this work was to investigate the effects of changes in DNA topology on this process. Methods. We used the kinetic approach, proposed earlier by us, to measure a relative amount of DNA in the comet tails as a function of time in the presence of different concentrations of chloroquine, a widely used intercalator. Results. We have shown that, at given small concentrations, intercalation of chloroquine strongly facilitates the comet tail formation. At the same time, some part of DNA (about 8 %) in the nucleoids exits very fast independently on chloroquine, while the largest part of DNA (about three quarters) does not exit at all. At high concentrations the intercalator increases the fraction of DNA, which cannot exit. Conclusions. Our results imply that the loop domains, which contain about one to several hundreds kilobases, represent only a small part (about a quarter) of DNA in the nucleus. The intercalation induces detachment of these loops from the nuclear matrix. Keywords: comet assay, chloroquine, intercalation, DNA loops, supercoiling.При електрофорезі ізольованих клітин (кометному електрофорезі) ДНК виходить з лізованих клітин (нуклеоїдів) у напрямку до аноду, утворюючи трек, що нагадує хвіст комети. Мета роботи полягала у вивченні впливу топологічних змін у ДНК на цей процес. Методи. Використано запропонований нами раніше кінетичний підхід для вимірювання відносного вмісту ДНК у хвостах комет залежно від часу за присутності різних концентрацій хлорокіну – одного з відомих інтеркаляторів. Результати. Показано, що за певних низьких концентрацій інтеркаляція хлорокіну суттєво прискорює формування хвостів комет. З іншого боку, невелика кількість ДНК нуклеоїдів (близько 8 %) виходить дуже швидко незалежно від хлорокіну, тоді як більша частина (приблизно три чверті) – не виходить взагалі. За високих концентрацій інтеркалятора зростає ця нездатна до виходу частина ДНК. Висновки. Одержані результати вказують на те, що петельні домени, які містять від однієї до кількох сотень пар основ, представляють лише малу частину (близько чверті) усієї ДНК нуклеоїда. Інтеркаляція спричиняє від’єднання цих петель від ядерного матриксу. Ключові слова: кометний електрофорез, хлорокін, інтеркаляція, петлі ДНК, надспіралізація.При электрофорезе изолированных клеток (кометном электрофорезе) ДНК выходит из лизированных клеток (нуклеоидов) в направлении анода, формируя трек, напоминающий хвост кометы. Цель работы состояла в изучении влияния топологических изменений в ДНК на этот процесс. Методы. Использован предложенный нами ранее кинетический подход для измерения относительного содержания ДНК в хвостах комет в зависимости от времени в присутствии различных концентраций хлорокина – одного из известных интеркаляторов. Результаты. Показано, что при определенных низких концентрациях интеркаляция хлорокина существенно ускоряет формирование хвостов комет. С другой стороны, небольшое количество ДНК нуклеоидов (около 8 %) выходит очень быстро независимо от хлорокина, тогда как большая часть (приблизительно три четверти) – не выходит вообще. При высоких концентрациях интеркалятора увеличивается эта неспособная к выходу часть ДНК. Выводы. Наши результаты указывают на то, что петельные домены, содержащие от одной до нескольких сотен пар нуклеотидов, составляют только малую часть (около четверти) всей ДНК нуклеоида. Интеркаляция вызывает отсоединение этих петель от ядерного матрикса. Ключевые слова: кометный электрофорез, хлорокин, интеркаляция, петли ДНК, сверхспирализация