Prolin als osmotische Schutzsubstanz und Nahrungsquelle

In dem Gram+ Bakterium Bacillus subtilis spielt Prolin eine wichtige Rolle. Als proteinogene Aminosäure ist es essentiell für die Biosynthese von Proteinen, es findet als Kohlen- oder Stickstoffquelle Verwendung und es fungiert außerdem als osmotische Schutzsubstanz. B. subtilis besitzt zwei Wege um Prolin de novo zu synthetisieren: die anabole und die osmoadaptive Prolinbiosynthese. Beide Wege sind über das gemeinsam genutzte Enzym ProA miteinander verknüpft. Die Deletion von proA führt zu einer Störung in der Prolinbiosynthese. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass Suppressor-Mutationen innerhalb der rocR-rocDEF-Region diese Störung durch die Rekrutierung des Argininabbau-Weges für die Prolin Neusynthese ausgleichen können. Zwei Klassen von Mutationen konnten identifiziert werden: (i) einzelner Aminosäureaustausch im Aktivatorprotein RocR führt zu teilweise Induktor unabhängigen RocR*-Proteinen; (ii) Mutationen in der Promotorregion von rocDEF führen zur Aktivierung eines kryptischen SigA-abhängigen Promotors. In beiden Fällen kam es zu einer erhöhten Transkription des rocDEF-Operons, was die Erhöhung der Menge an RocD in der Zelle zur Folge hatte. RocD als Teil des Argininabbau-Weges produziert dabei dasselbe Produkt wie ProA und kann somit dessen Fehlen ersetzen. Außerdem entwickelte sich dabei ein völlig neuer regulatorischer Mechanismus für die Expression des rocDEF-Operons, da dessen Expression nun auch in Anwesenheit von Ammonium durch Prolin induziert werden konnte. Dies demonstriert wie effektiv sich Bakterien an Einschränkungen innerhalb essentieller Stoffwechselwege anpassen können. In seinem natürlichen Habitat ist B. subtilis ständig wechselnden Umweltbedingungen, wie die Osmolarität, ausgesetzt. Die Anpassung an hochosmolare Bedingungen erfolgt dabei durch die osmotisch kontrollierte de novo Synthese von Prolin, oder durch dessen Aufnahme aus der Umgebung. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass prolinhaltige Peptide ebenfalls eine osmoprotektive Wirkung besitzen. Nach dem Import der Peptide durch spezielle Peptidtransporter (App, Dpp, Opp, DtpT) kommt es intrazellulär zu deren Spaltung, was zu einer Freisetzung des Prolins führt. Durch die Akkumulation dieses Prolins kommt es zu einem Schutz der osmotisch gestressten Zelle. Die an der Spaltung der Xaa-Pro bzw. Xaa-Pro-Xaa Peptide beteiligten Peptidasen konnten identifiziert werden: PapA (YqhT) und PapB (YkvY). Dies fügt einen neuen Aspekt in der Nutzung von Prolin als osmotische Schutzsubstanz durch B. subtilis hinzu und demonstriert wie gewinnbringend die im Habitat verfügbaren Ressourcen zum Schutz vor osmotischem Stress genutzt werden können. B. subtilis besitzt neben den beiden bekannten Prolintransportern (PutP, OpuE) noch ein weiteres, bisher unbekanntes Prolinaufnahmesystem. In dieser Arbeit wurde für dessen Identifizierung ein genetisches Screening-Verfahren entwickelt. In einem Stamm der Prolin nicht mehr aktiv in die Zelle aufnehmen kann, wurden trotz externer Zugabe von Prolin die Gene des Prolinabbau-Weges (putBCP) nicht mehr exprimiert. Dies demonstriert, dass der Import des externen Prolins in die Zelle, die Voraussetzung für die Induktion der Transkription von putBCP ist. Die im Rahmen dieser Arbeit erlangten Erkenntnisse enthüllen weitere Facetten der physiologischen Rolle von Prolin in B. subtilis und zeigen außerdem sehr eindrucksvoll, wie effektiv sich Bakterien an die unterschiedlichsten Veränderungen anpassen können

The ␥-Aminobutyrate Permease GabP Serves as the Third Proline Transporter of Bacillus subtilis

b PutP and OpuE serve as proline transporters when this imino acid is used by Bacillus subtilis as a nutrient or as an osmostress protectant, respectively. The simultaneous inactivation of the PutP and OpuE systems still allows the utilization of proline as a nutrient. This growth phenotype pointed to the presence of a third proline transport system in B. subtilis. We took advantage of the sensitivity of a putP opuE double mutant to the toxic proline analog 3,4-dehydro-DL-proline (DHP) to identify this additional proline uptake system. DHP-resistant mutants were selected and found to be defective in the use of proline as a nutrient. Whole-genome resequencing of one of these strains provided the lead that the inactivation of the ␥-aminobutyrate (GABA) transporter GabP was responsible for these phenotypes. DNA sequencing of the gabP gene in 14 additionally analyzed DHPresistant strains confirmed this finding. Consistently, each of the DHP-resistant mutants was defective not only in the use of proline as a nutrient but also in the use of GABA as a nitrogen source. The same phenotype resulted from the targeted deletion of the gabP gene in a putP opuE mutant strain. Hence, the GabP carrier not only serves as an uptake system for GABA but also functions as the third proline transporter of B. subtilis. Uptake studies with radiolabeled GABA and proline confirmed this conclusion and provided information on the kinetic parameters of the GabP carrier for both of these substrates

Prolin als osmotische Schutzsubstanz und Nahrungsquelle

In dem Gram+ Bakterium Bacillus subtilis spielt Prolin eine wichtige Rolle. Als proteinogene Aminosäure ist es essentiell für die Biosynthese von Proteinen, es findet als Kohlen- oder Stickstoffquelle Verwendung und es fungiert außerdem als osmotische Schutzsubstanz. B. subtilis besitzt zwei Wege um Prolin de novo zu synthetisieren: die anabole und die osmoadaptive Prolinbiosynthese. Beide Wege sind über das gemeinsam genutzte Enzym ProA miteinander verknüpft. Die Deletion von proA führt zu einer Störung in der Prolinbiosynthese. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass Suppressor-Mutationen innerhalb der rocR-rocDEF-Region diese Störung durch die Rekrutierung des Argininabbau-Weges für die Prolin Neusynthese ausgleichen können. Zwei Klassen von Mutationen konnten identifiziert werden: (i) einzelner Aminosäureaustausch im Aktivatorprotein RocR führt zu teilweise Induktor unabhängigen RocR*-Proteinen; (ii) Mutationen in der Promotorregion von rocDEF führen zur Aktivierung eines kryptischen SigA-abhängigen Promotors. In beiden Fällen kam es zu einer erhöhten Transkription des rocDEF-Operons, was die Erhöhung der Menge an RocD in der Zelle zur Folge hatte. RocD als Teil des Argininabbau-Weges produziert dabei dasselbe Produkt wie ProA und kann somit dessen Fehlen ersetzen. Außerdem entwickelte sich dabei ein völlig neuer regulatorischer Mechanismus für die Expression des rocDEF-Operons, da dessen Expression nun auch in Anwesenheit von Ammonium durch Prolin induziert werden konnte. Dies demonstriert wie effektiv sich Bakterien an Einschränkungen innerhalb essentieller Stoffwechselwege anpassen können. In seinem natürlichen Habitat ist B. subtilis ständig wechselnden Umweltbedingungen, wie die Osmolarität, ausgesetzt. Die Anpassung an hochosmolare Bedingungen erfolgt dabei durch die osmotisch kontrollierte de novo Synthese von Prolin, oder durch dessen Aufnahme aus der Umgebung. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass prolinhaltige Peptide ebenfalls eine osmoprotektive Wirkung besitzen. Nach dem Import der Peptide durch spezielle Peptidtransporter (App, Dpp, Opp, DtpT) kommt es intrazellulär zu deren Spaltung, was zu einer Freisetzung des Prolins führt. Durch die Akkumulation dieses Prolins kommt es zu einem Schutz der osmotisch gestressten Zelle. Die an der Spaltung der Xaa-Pro bzw. Xaa-Pro-Xaa Peptide beteiligten Peptidasen konnten identifiziert werden: PapA (YqhT) und PapB (YkvY). Dies fügt einen neuen Aspekt in der Nutzung von Prolin als osmotische Schutzsubstanz durch B. subtilis hinzu und demonstriert wie gewinnbringend die im Habitat verfügbaren Ressourcen zum Schutz vor osmotischem Stress genutzt werden können. B. subtilis besitzt neben den beiden bekannten Prolintransportern (PutP, OpuE) noch ein weiteres, bisher unbekanntes Prolinaufnahmesystem. In dieser Arbeit wurde für dessen Identifizierung ein genetisches Screening-Verfahren entwickelt. In einem Stamm der Prolin nicht mehr aktiv in die Zelle aufnehmen kann, wurden trotz externer Zugabe von Prolin die Gene des Prolinabbau-Weges (putBCP) nicht mehr exprimiert. Dies demonstriert, dass der Import des externen Prolins in die Zelle, die Voraussetzung für die Induktion der Transkription von putBCP ist. Die im Rahmen dieser Arbeit erlangten Erkenntnisse enthüllen weitere Facetten der physiologischen Rolle von Prolin in B. subtilis und zeigen außerdem sehr eindrucksvoll, wie effektiv sich Bakterien an die unterschiedlichsten Veränderungen anpassen können

Abundance of Novel and Diverse tfdA-Like Genes, Encoding Putative Phenoxyalkanoic Acid Herbicide-Degrading Dioxygenases, in Soil▿ †

Phenoxyalkanoic acid (PAA) herbicides are widely used in agriculture. Biotic degradation of such herbicides occurs in soils and is initiated by α-ketoglutarate- and Fe2+-dependent dioxygenases encoded by tfdA-like genes (i.e., tfdA and tfdAα). Novel primers and quantitative kinetic PCR (qPCR) assays were developed to analyze the diversity and abundance of tfdA-like genes in soil. Five primer sets targeting tfdA-like genes were designed and evaluated. Primer sets 3 to 5 specifically amplified tfdA-like genes from soil, and a total of 437 sequences were retrieved. Coverages of gene libraries were 62 to 100%, up to 122 genotypes were detected, and up to 389 genotypes were predicted to occur in the gene libraries as indicated by the richness estimator Chao1. Phylogenetic analysis of in silico-translated tfdA-like genes indicated that soil tfdA-like genes were related to those of group 2 and 3 Bradyrhizobium spp., Sphingomonas spp., and uncultured soil bacteria. Soil-derived tfdA-like genes were assigned to 11 clusters, 4 of which were composed of novel sequences from this study, indicating that soil harbors novel and diverse tfdA-like genes. Correlation analysis of 16S rRNA and tfdA-like gene similarity indicated that any two bacteria with D > 20% of group 2 tfdA-like gene-derived protein sequences belong to different species. Thus, data indicate that the soil analyzed harbors at least 48 novel bacterial species containing group 2 tfdA-like genes. Novel qPCR assays were established to quantify such new tfdA-like genes. Copy numbers of tfdA-like genes were 1.0 × 106 to 65 × 106 per gram (dry weight) soil in four different soils, indicating that hitherto-unknown, diverse tfdA-like genes are abundant in soils

Adaptation of Bacillus subtilis carbon core metabolism to simultaneous nutrient limitation and osmotic challenge:A multi-omics perspective

The Gram-positive bacterium Bacillus subtilis encounters nutrient limitations and osmotic stress in its natural soil ecosystem. To ensure survival and sustain growth, highly integrated adaptive responses are required. Here, we investigated the system-wide response of B.subtilis to different, simultaneously imposed stresses. To address the anticipated complexity of the cellular response networks, we combined chemostat experiments under conditions of carbon limitation, salt stress and osmoprotection with multi-omics analyses of the transcriptome, proteome, metabolome and fluxome. Surprisingly, the flux through central carbon and energy metabolism is very robust under all conditions studied. The key to achieve this robustness is the adjustment of the biocatalytic machinery to compensate for solvent-induced impairment of enzymatic activities during osmotic stress. Specifically, increased production of several enzymes of central carbon metabolism compensates for their reduced activity in the presence of high salt. A major response of the cell during osmotic stress is the production of the compatible solute proline. This is achieved through the concerted adjustment of multiple reactions around the 2-oxoglutarate node, which drives metabolism towards the proline precursor glutamate. The fine-tuning of the transcriptional and metabolic networks involves functional modules that overarch the individual pathways

The earthworm Aporrectodea caliginosa stimulates abundance and activity of phenoxyalkanoic acid herbicide degraders

2-Methyl-4-chlorophenoxyacetic acid (MCPA) is a widely used phenoxyalkanoic acid (PAA) herbicide. Earthworms represent the dominant macrofauna and enhance microbial activities in many soils. Thus, the effect of the model earthworm Aporrectodea caliginosa (Oligochaeta, Lumbricidae) on microbial MCPA degradation was assessed in soil columns with agricultural soil. MCPA degradation was quicker in soil with earthworms than without earthworms. Quantitative PCR was inhibition-corrected per nucleic acid extract and indicated that copy numbers of tfdA-like and cadA genes (both encoding oxygenases initiating aerobic PAA degradation) in soil with earthworms were up to three and four times higher than without earthworms, respectively. tfdA-like and 16S rRNA gene transcript copy numbers in soil with earthworms were two and six times higher than without earthworms, respectively. Most probable numbers (MPNs) of MCPA degraders approximated 4 × 105 gdw−1 in soil before incubation and in soil treated without earthworms, whereas MPNs of earthworm-treated soils were approximately 150 × higher. The aerobic capacity of soil to degrade MCPA was higher in earthworm-treated soils than in earthworm-untreated soils. Burrow walls and 0–5 cm depth bulk soil displayed higher capacities to degrade MCPA than did soil from 5–10 cm depth bulk soil, expression of tfdA-like genes in burrow walls was five times higher than in bulk soil and MCPA degraders were abundant in burrow walls (MPNs of 5 × 107 gdw−1). The collective data indicate that earthworms stimulate abundance and activity of MCPA degraders endogenous to soil by their burrowing activities and might thus be advantageous for enhancing PAA degradation in soil