Human retinal organoids - Exploration of a human induced pluripotent stem cell-derived in vitro model

Die Wahrnehmung von Lichtreizen durch unsere Augen ist vermutlich der fundamentalste Sinn, der einem Menschen zu Verfügung steht, um mit seiner Umwelt zu interagieren und diese zu erleben. Gerade deshalb ist der Verlust des Augenlichtes ein extremer Einschnitt in die Lebensqualität eines jeden Menschen. Zwei der häufigsten erblichen Erkrankungen, die zur Erblindung führen, sind Retinitis Pigmentosa (RP) und die Leber’sche Kongenitale Amaurose (LCA). Bei diesen degenerativen Retina-Erkrankungen führt das progressive Absterben von Photorezeptoren zu einem unaufhaltsamen Verlust der Lichtwahrnehmung. Einer der häufigsten genetischen Ursachen dafür sind Mutationen im CRB1 Gen, welches vermutlich normalerweise an der Polarisierung und Stabilität von Epithelzellen und Photorezeptoren beteiligt ist. Um zukünftig Therapieformen zu entwickeln, die eine Linderung oder gar Heilung erreichen könnten, müssen die pathologischen Veränderungen, die mit der Krankheit einhergehen, genauestens studiert und verstanden werden. Eine neue und vielversprechende Möglichkeit dies zu erreichen, ist die Entwicklung von selbstformierenden und selbstorganisierenden retinalen Organoiden (RO), die aus induziert pluripotenten Stammzellen (IPSZ) abgeleitet werden können. Diese retinalen Organoide beinhalten alle Zelltypen einer menschlichen Retina inklusive Stäbchen, Zapfen und retinalen Müller Glia Zellen. Darüber hinaus verfügen sie über eine fortgeschrittene Form der Organisation, die ähnlich einer menschlichen Retina in spezifischen Schichten angeordnet ist. Des Weiteren beinhalten die RO physiologisch relevante synaptische Verknüpfungen und können sogar auf Lichtreize reagieren. In dieser Arbeit habe ich auf Basis publizierter Protokolle die Differenzierung von RO aus induziert pluripotenten Stammzellen etabliert, die auf einer Mischung aus Adhärenz- und Suspensionskultur basiert. Um die Effekte von Retinitis Pigmentosa mit zugrundeliegender CRB1 Mutation zu untersuchen, kreierte ich iPS Zelllinien von zwei RP Patienten (RPA, RPB), die eine homozygote C948Y Mutation tragen. Die daraus generierten RO wurden mithilfe von Immunzytochemie (ICC), Transkriptom- Analysen mittels qRT-PCR sowie ultrastruktureller Bildgebung mittels Elektronenmikroskopie und funktioneller Evaluierung durch Calcium Imaging analysiert. Um ICC Färbungen effektiv und objektiv quantifizieren zu können, wurde ein Analyseverfahren entwickelt, das auf verschiedenen ImageJ und R-Macro Programmen basiert. Die wichtigsten Resultate dieser Arbeit sind erstens die Etablierung eines validen iPSZ-basiertes in vitro Retina Modells und zugleich die Analyse der wichtigsten Differenzierungsschritte mithilfe von bekannten Zellmarkern und transkriptomischen Analysen. Zweitens, die Entwicklung einer neuartigen Methodik um Fluoreszenzbilder von retinalen Organoiden einfach und objektiv zu quantifizieren. Drittens, die Nutzung der RO für das Modellieren von Retinitis Pigmentosa, verursacht durch CRB1 Mutationen. Hierbei konnte ich vor allem ein verändertes CRB1 Expressionsmuster feststellen, sowie deutliche Hinweise auf veränderte Signalwege und darüber hinaus eine verminderte Lichtaktivität von retinalen Photorezeptoren. Dennoch war es selbst nach einem Jahr Kultur nicht möglich, deutliche Zeichen von Photorezeptordegeneration zu beobachten. Aufgrund dieser Limitierungen und um das Modellieren von Retinaerkrankungen in Zukunft möglicherweise zu verbessern, kreierte ich, aus den im Rahmen dieser Arbeit entstandenen Daten, ein Organ-on-a-chip System, welches eine bisher nicht kontrolliert mögliche Interaktion zwischen Photorezeptor und retinaler Pigmentepithelzelle erlaubt. Zusammen mit dem hier präsentierten Krankheitsmodell möchte ich damit in Zukunft zum besseren Verständnis von degenerativen Retinaerkrankungen beitragen und darüber hinaus eine Verbesserung von in vitro Retinamodellen erzielen

Organoids and organ chips in ophthalmology

Recent advances have driven the development of stem cell-derived, self-organizing, three-dimensional miniature organs, termed organoids, which mimic different eye tissues including the retina, cornea, and lens. Organoids and engineered microfluidic organ-on-chips (organ chips) are transformative technologies that show promise in simulating the architectural and functional complexity of native organs. Accordingly, they enable exploration of facets of human disease and development not accurately recapitulated by animal models. Together, these technologies will increase our understanding of the basic physiology of different eye structures, enable

Generation of Functional Vascular Endothelial Cells and Pericytes from Keratinocyte Derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived endothelial cells (ECs) and pericytes provide a powerful tool for cardiovascular disease modelling, personalized drug testing, translational medicine, and tissue engineering. Here, we report a novel differentiation protocol that results in the fast and efficient production of ECs and pericytes from keratinocyte-derived hiPSCs. We found that the implementation of a 3D embryoid body (EB) stage significantly improves the differentiation efficiency. Compared with the monolayer-based technique, our protocol yields a distinct EC population with higher levels of EC marker expression such as CD31 and vascular endothelial cadherin (VE-cadherin). Furthermore, the EB-based protocol allows the generation of functional EC and pericyte populations that can promote blood vessel-like structure formation upon co-culturing. Moreover, we demonstrate that the EB-based ECs and pericytes can be successfully used in a microfluidic chip model, forming a stable 3D microvascular network. Overall, the described protocol can be used to efficiently differentiate both ECs and pericytes with distinct and high marker expression from keratinocyte-derived hiPSCs, providing a potent source material for future cardiovascular disease studies

Generation of Functional Vascular Endothelial Cells and Pericytes from Keratinocyte Derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cell (hiPSC)-derived endothelial cells (ECs) and pericytes provide a powerful tool for cardiovascular disease modelling, personalized drug testing, translational medicine, and tissue engineering. Here, we report a novel differentiation protocol that results in the fast and efficient production of ECs and pericytes from keratinocyte-derived hiPSCs. We found that the implementation of a 3D embryoid body (EB) stage significantly improves the differentiation efficiency. Compared with the monolayer-based technique, our protocol yields a distinct EC population with higher levels of EC marker expression such as CD31 and vascular endothelial cadherin (VE-cadherin). Furthermore, the EB-based protocol allows the generation of functional EC and pericyte populations that can promote blood vessel-like structure formation upon co-culturing. Moreover, we demonstrate that the EB-based ECs and pericytes can be successfully used in a microfluidic chip model, forming a stable 3D microvascular network. Overall, the described protocol can be used to efficiently differentiate both ECs and pericytes with distinct and high marker expression from keratinocyte-derived hiPSCs, providing a potent source material for future cardiovascular disease studies

TBX3 Knockdown Decreases Reprogramming Efficiency of Human Cells

TBX3 is a member of the T-box transcription factor family and is involved in the core pluripotency network. Despite this role in the pluripotency network, its contribution to the reprogramming process during the generation of human induced pluripotent stem cells remains elusive. In this respect, we performed reprogramming experiments applying TBX3 knockdown in human fibroblasts and keratinocytes. Knockdown of TBX3 in both somatic cell types decreased the reprogramming efficiencies in comparison to control cells but with unchanged reprogramming kinetics. The resulting iPSCs were indistinguishable from control cells and displayed a normal in vitro differentiation capacity by generating cells of all three germ layers comparable to the controls