Izolacija iz periferne krvi i analiza funkcija heterofila kokoši protočnom citometrijom – metodološko istraživanje

The aim of this study was to modify the flow cytometric method, which is used for analyzing neutrophils, to analyse the functions of avian heterophils. The blood samples used in the experiments were obtained from hens in slaughterhouses. Blood samples were collected from 10 hens for each trial. Within the scope of the present study, trials were carried out regarding the amount of blood, cell suspension, dihydrorodamine-123 (DHR-123), phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA), and N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP), as well as the storage duration of blood samples and incubation time. The results showed that 0.5-3 ml of blood could be used to detect heterophil functions, and it would be ideal to conduct analyses using fresh blood samples. In addition, the results showed that blood stored at +4 °C for up to 8 hours may be also used if necessary. In order to isolate the cells, centrifugation for 30 minutes is sufficient, and it is appropriate to use a 30μL cell suspension. 2μL of DHR-123 should be used as a chemical probe to measure heterophil functions. Excessive use of DHR-123 affected the heterophil functions negatively. In addition, it was observed that using 2μL of fMLP, which is used as an oxidative burst stimulant, and 2μL of PMA as a stimulant of chemotaxic activity, were sufficient. It was concluded that incubation at 41 °C for 5 minutes after stimulating the heterophils is also sufficient. We conclude that the methods established in this study could be used to isolate heterophils and to analyze them by flow cytometry. Therefore, this study would contribute to further research and clinical studies in poultry.Cilj je istraživanja bio prilagoditi metodu protočne citometrije, koja se inače primjenjuje u analizi neutrofila, za analizu funkcija ptičjih heterofila. Uzorci krvi 10 kokoši dobiveni su iz klaonica. Uzevši u obzir količinu krvi, kao i trajanje pohrane krvnih uzoraka odnosno vrijeme inkubacije, analizirana su stanična suspenzija, dihidrorodamin-123 (DHR-123), forbol-12-miristat-13-acetat (PMA) i N-formil-metionil-leucil-fenilalanin (fMLP). Rezultati su pokazali da se 0,5 – 3 mL krvi može upotrijebiti za otkrivanje funkcija heterofila te da bi idealno bilo analizirati svježe uzorke krvi. Osim toga rezultati su pokazali da se i krv pohranjena na temperaturi od +4 °C, u vremenu do 8 sati, može upotrijebiti ako je to potrebno. Kako bi se stanice izolirale, dovoljno je centrifugirati 30 minuta uz primjenu stanične suspenzije od 30 μL. Kao kemijsku probu za mjerenje funkcija heterofila trebalo bi upotrijebiti 2 μL DHR-123. Prekomjerna upotreba DHR-123 negativno je utjecala na funkcije heterofila. Također, uočeno je da je bila dovoljna primjena 2 μL fMLP-a, koji služi kao stimulans oksidacijskog izgaranja, kao i primjena 2 μL PMA-a kao stimulansa kemotaktičke aktivnosti. Zaključeno je da je inkubacija na temperaturi od 41 °C, tijekom 5 minuta poslije stimulacije heterofila također dovoljna. Rezultati su pokazali da se metode ustanovljene u ovom radu mogu primijeniti za izolaciju heterofila i njihovu analizu protočnom citometrijom, čime se doprinosi daljnjim istraživanjima i kliničkim studijama u peradi

Firma Performansını Etkileyen Faktörlerin Yapısal Eşitlik Modeli ile İncelenmesi

ISBN: 978-605-85483-3-