Untersuchungen zur Stabilität und Konjugation der Plasmide pCM1 und pCM2 von Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis

Abt B. Untersuchungen zur Stabilität und Konjugation der Plasmide pCM1 und pCM2 von Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis. Bielefeld (Germany): Bielefeld University; 2008.Die Plasmide von Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis NCPPB382 (Cmm), pCM1 und pCM2, tragen die für die Virulenz essentiellen Pathogenitätsdeterminanten celA und pat-1. Nach der vollständigen Sequenzierung und Annotation des Cmm-Genoms konnten auf beiden Plasmiden potentielle Transferregionen bestimmt werden, die im Rahmen dieser Arbeit partiell charakterisiert worden sind. Die Analyse der Aminosäuresequenz des von pCM2 codierten TraA zeigte, dass TraA sowohl eine Helicase- als auch eine Relaxase-Domäne aufweist. Die Inaktivierung des traA-Gens führte zum Verlust der Transferfähigkeit von pCM2. Auch die jeweilige Inaktivierung der pCM2-Gene trbL und traE, letzteres codiert für ein hypothetisches VirB4-Homolog, hatte den Verlust der Konjugationsfähigkeit zur Folge. Ebenso führten die Mutationen in den Genen orfI und orfM der hypothetischen Transferregion von pCM1 zu transfernegativen pCM1-Derivaten. Die auf pCM1 und pCM2 identifizierten Regionen sind also für den konjugativen Plasmidtransfer essentiell. Durch die zum Teil detaillierte Analyse der Transferbedingungen von pCM2 konnte die Filterkreuzungsmethode für Cmm etabliert und standardisiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von Kohlenhydraten, wie z.B. Glucose, Fructose oder Saccharose, für den Nachweis des Plasmidtransfers in einem filter mating notwendig ist. Konjugation der Cmm-Plasmide bei Anzucht in Flüssigkultur war unter den gewählten Testbedingungen nicht nachweisbar. In Filterkreuzungsexperimenten verringerte ein zehnfacher Donor-Überschuss die Transferhäufigkeit von pCM2 um den Faktor 30, während die zehnfache Rezipienten-Anzahl keine Auswirkungen auf die Transferhäufigkeit hatte. Durch die Aufnahme der Kinetik des Plasmidtransfers während der ersten 12 Stunden eines filter matings konnte für pCM2 eine Transferrate zwischen 4 × 10^-9 und 4 × 10^-8 Transkonjuganten pro Donor pro Minute über einen Zeitraum von einer Stunde ermittelt werden. Die Transferhäufigkeit der Cmm-Plasmide wurde mit der standardisierten Filterkreuzungsmethode bestimmt. pCM1 hat eine relativ geringe Transferhäufigkeit von durchschnittlich 1,4 × 10^-8 Transkonjuganten pro reisoliertem Rezipienten. Damit ist sie um bis zu 4 Zehnerpotenzen geringer als die Transferhäufigkeit von pCM2, die zwischen 7,1 × 10^-6 und 1,2 × 10^-4 Transkonjuganten pro reisoliertem Rezipienten variieren kann. Es gibt erste Indizien für die Existenz eines vom Rezipienten ausgesendeten Signalmoleküls, das in den Donorzellen den Plasmidtransfer anregt. Allerdings muss diese Vermutung z.B. durch Microarray-Experimente überprüft werden. Segregationsexperimente in Flüssigkultur haben gezeigt, dass die Stabilität von pCM2 unter einer erhöhten Anzuchttemperatur von 32 °C abnimmt. Durch den Vergleich der Stabilität des konjugativen pCM2Nm und des nicht konjugativen pCM2traE wurde deutlich, dass in planta die Konjugationsfähigkeit zur stabilen Erhaltung von pCM2Nm auch unter der erhöhten Kultivierungstemperatur beiträgt. Der Verlust von pCM2 kann in einem System, das Konjugation ermöglicht, durch die konjugative Wiederaufnahme des Plasmids kompensiert werden