Ricerche sulla crioconservazione di embrioni di Lepidotteri: sviluppo embrionale e sopravvivenza a seguito di trattamenti con agenti crioprotettivi

L’applicazione delle tecniche di crioconservazione, già sviluppate per gli embrioni di mammiferi, alla conservazione del germoplasma di artropodi presenta difficoltà legate all’elevata sensibilità al congelamento degli embrioni e alla riduzione della permeabilità ai crioprotettivi dovuta alla presenza dei rivestimenti esterni delle uova ( corion e membrana vitellina). Obiettivo del presente lavoro è la definizione di protocolli di conservazione di uova di Lepidotteri, condotte utilizzando stadi embrionali diversi di due specie modello di rilevante importanza nei settori degli studi di base e delle ricerche di tipo applicato, Galleria mellonella L. e Bombyx mori L. Studi preliminari sull’embriologia di queste due specie ci hanno permesso d’individuare gli con più elevata resistenza agli stress termici e quindi maggiormente idonei per le successive prove di crioconservazione. Vari protocolli per la decorionizzazione e permeabilizzazione degli embrioni sono stati messi a confronto

Novel staining procedures for whole mount preparations of greater wax moth (Galleria mellonella) embryos: toluidine blue-rhodamine B, plus calcofluor white

Although hematoxylin and eosin (H & E) staining of sectioned embryonic insect material is widely used, it is time-consuming and may not provide sufficient information. We evaluated new staining procedures for embryonic whole mounts of the greater wax moth, Galleria mellonella. We compared a combination of toluidine blue and rhodamine B (TB-RB) to H & E; we also investigated calcofluor white (CFW) staining. TB-RB staining produced staining similar to H & E. TB-RB staining was less time-consuming and improved visualization of the blastoderm and its differentiation into the germ disk and serosa membrane. CFW enhanced details of mitosis in nuclei post-fertilization and stained the primary serosal membrane. Staining of whole mounts with TB-RB and CFW enabled embryonic staging that was more rapid, convenient and effective than the routine approach using H & E and fluorescent probes

Stato dell’arte sullo sviluppo delle tecniche di crioconservazione per la conservazione del germoplasma degli insetti.

L’applicazione delle tecniche di crioconservazione, già sviluppate per gli embrioni di mammiferi, alla conservazione del germoplasma di artropodi è di grande interesse scientifico ed economico, ma presenta difficoltà legate all’elevata sensibilità al congelamento degli embrioni e alla riduzione della permeabilità ai crioprotettivi dovuta alla presenza dei rivestimenti esterni delle uova ( corion e membrana vitellina). Tali aspetti sono stati affrontati con risultati variabili, ma talora molto incoraggianti dalla ricerca scientifica nell’ultimo ventennio. In questo lavoro viene riportata una revisione bibliografica dell’argomento

Preliminary studies on the cryopreservation of silkworm (Bombyx mori)

Developing a technique for the cryopreservation of Bombyx mori L. germplasm may provide significant benefits for supplying good strains to farmers and facilitate the conservation of living material in genetic banks. Producing species-specific protocols for the selection of the most apt embryonic stage, dechorionation/permeabilization of eggshells, and the acclimation at low temperature before the treatment of eggs at cryogenic temperature is a prerequisite for cryopreservation of B. mori embryos. In this research, non-diapausing eggs of B. mori Nistari strain were used to study cold hardiness; the final aim was to select the most apt embryonic development stages, and in addition, reliable permeabilization, and vitrification treatments. Polyhybrid B. mori eggs of a diapausing strain were also used for comparison in experiments of embryogenesis, permeability, and acclimation under low temperature before cryopreservation. The Nistari eggs in the stage of 24 hours post-oviposition (h PO) showed a scarce survival rate (0.1%) after their submersion in liquid nitrogen (LN), while the highest survival in loading and dehydration with cryoprotective agents was assessed in 40h PO eggs. Overwintering diapausing eggs preserved for three months at 5 degrees C and then treated with various vitrification solutions gave rise to good hatching rates. The achieved results show that it is possible to improve the method of cryopreservation of B. mori eggs by obtaining a good permeability with cryoprotectants at loading/dehydration steps and by decreasing the toxicity, reducing the treatment time