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Mutations in NSUN2 Cause Autosomal- Recessive Intellectual Disability
With a prevalence between 1 and 3%, hereditary forms of intellectual disability (ID) are among the most important problems in health care. Particularly, autosomal-recessive forms of the disorder have a very heterogeneous molecular basis, and genes with an increased number of disease-causing mutations are not common. Here, we report on three different mutations (two nonsense mutations, c.679C>T [p.Gln227∗] and c.1114C>T [p.Gln372∗], as well as one splicing mutation, g.6622224A>C [p.Ile179Argfs∗192]) that cause a loss of the tRNA-methyltransferase-encoding NSUN2 main transcript in homozygotes. We identified the mutations by sequencing exons and exon-intron boundaries within the genomic region where the linkage intervals of three independent consanguineous families of Iranian and Kurdish origin overlapped with the previously described MRT5 locus. In order to gain further evidence concerning the effect of a loss of NSUN2 on memory and learning, we constructed a Drosophila model by deleting the NSUN2 ortholog, CG6133, and investigated the mutants by using molecular and behavioral approaches. When the Drosophila melanogaster NSUN2 ortholog was deleted, severe short-term-memory (STM) deficits were observed; STM could be rescued by re-expression of the wild-type protein in the nervous system. The humans homozygous for NSUN2 mutations showed an overlapping phenotype consisting of moderate to severe ID and facial dysmorphism (which includes a long face, characteristic eyebrows, a long nose, and a small chin), suggesting that mutations in this gene might even induce a syndromic form of ID. Moreover, our observations from the Drosophila model point toward an evolutionarily conserved role of RNA methylation in normal cognitive development
Identifizierung von drei neuen Genen für autosomal rezessive geistige Behinderung und molekulare Charakterisierung der zugrundeliegenden Gendefekte
Intellectual disability (ID), one of the most complex disorders, has a
worldwide prevalence of approximately 2% and is a frequent cause of severe
disability. Therefore this disorder constitutes a major burden not only on the
affected families but also on society. It has become clear that X-linked forms
account for only ten percent of ID cases, which means that the vast majority
of the underlying genetic defects must be autosomal, but it has so far
received considerably less attention. A particularly straightforward strategy
for the identification of genes underlying autosomal recessive disorders is
homozygosity mapping in extended consanguineous families, followed by mutation
screening of candidate genes. In Western societies, where most of the research
takes place, its investigation has been hampered by infrequent parental
consanguinity and small family sizes. Therefore, to unravel the molecular
basis of ARID in a systematic fashion as a prerequisite for diagnosis,
counselling and therapy, we focused on large consanguineous Iranian families
with several mentally retarded children. During the course of our
investigations into the autosomal recessive causes of intellectual disability
(ARID,) we have identified numerous new loci for this condition. However, no
more than six hotspot loci for unspecific or non-syndromic autosomal recessive
intellectual disability (NS-ARID) have been identified, which may indicate
that, at least in the Iranian population, not all of the gene defects causing
NS-ARID are extremely rare and the possible existence of common molecular
causes for NS-ARID have not been ruled out. The work presented here is part of
this large project to shed more light on the molecular causes of ARID. In this
study the investigation of two out of these 6 hot spot loci led to the
identification of underlying gene defects. One of these involves the linkage
intervals of two Iranian families with several NS-ARID patients overlapping on
Chr19q13.2-q13.31. Two different missense mutations with high pathogenicity
scores were detected in ZNF526, which encodes a krueppel-type zinc finger
protein. One of these changes was observed in DNA samples collected from two
distinct families with nonsyndromic ID, but closer inspection revealed that
these families, which live in the same city in the Northwestern part of Iran,
share a common haplotype and thus must be distantly related. Each mutation
affects a functional domain of ZNF526 and both alter the protein conformation,
causing a putative functional impairment as suggested by in silico protein
modelling. A decrease in DNA affinity was confirmed by CHIP-seq, and array-
based gene expression studies showed specific changes in the expression
patterns of patient lymphoblastoid cells, which could be recapitulated in
ZNF526-deficient neuroblastoma cells. Functional annotation showed significant
enrichment of the deregulated genes in pathways that play a role in protein
synthesis, mitochondrial dysfunction, energy metabolism and gene regulation.
We could implicate that ZNF526 protein interacts with PRKRIR, which is a
transcription factor (TF) that has been added to human TF repertoire recently
in the primate history. Therefore ZNF526 and PRKRIR together are particularly
promising candidates in investigating the development and evolution of higher
brain function in primates. This study also resolved the underlying gene
defect of MRT5 and reported three deleterious mutations in NSUN2. These were
found in two independent consanguineous Iranian families and one Turkish
family with several patients suffering from non-syndromic ARID. NSUN2 encodes
a methyltransferase, which catalyzes the intron-dependent formation of 5-
methylcytosine at C34 of tRNA-leu(CAA). Hence all mutations lead to a loss of
NSUN2 protein function in homozygous mutation carriers and in all likelihood
cause the patient phenotype. In order to gain further evidence for an
involvement of NSUN2 in cognitive functions, we studied Drosophila mutants
that lack the NSUN2 ortholog. These experiments revealed a marked learning
impairment in mutant flies, which clearly underscores the relevance of NSUN2
in higher brain functions. Furthermore, this study was the first report on a
mutation in patients with dysequilibrium syndrome that affects VLDLR
exclusively, confirming the central role of the very low-density lipoprotein
receptor in the aetiology of this condition. The mutations in this gene have
been found to be associated with quadrupedal mobility in other families, but
not in our patients. In summary, our results show that both NSUN2 and ZNF526
belong to the still few genes known to carry NS-ID-causing mutations in
independent families, which suggests that defects in either gene belong to the
more common causes of NS-ARID, at least in the Iranian population. Further
studies are necessary to identify the disease causing mutations in the other 4
hot spot identified loci and to determine the contribution of the affected
genes to the complex processes of human cognition. These studies will be
greatly facilitated by exome enrichment and next generation sequencing (NGS),
which have recently been introduced as a cost-effective and fast strategy for
comprehensive mutation screening and disease-gene identification in the coding
portion of the human genome.Mentale Retardierung (MR), eine der komplexesten Erkrankungen, hat eine
weltweite Prävalenz von etwa 2% und ist ein häufiger Grund schwerster
Behinderung. Aus diesem Grund ist diese Erkrankung sowohl für die Familie als
auch für die Gesellschaft eine enorme Belastung. Es hat sich gezeigt, dass
genetische Defekte auf dem X-Chromosom nur für 10% aller Fälle von MR
verantwortlich sind, daher muss die überwältigende Mehrheit der genetischen
Defekte auf den Autosomen kodiert sein. Die Erforschung der autosomalen MR hat
bislang jedoch wesentlich weniger Aufmerksamkeit erhalten. Die Strategie zur
Identifizierung der an autosomal rezessiven Erbkrankheiten beteiligten Gene
umfasst, Homozygosity Mapping, in großen blutsverwandten Familien mit
anschließendem Sequenzieren der Kandidatengene um Mutationen aufzuspüren. In
westlichen Gesellschaften, wo ein Großteil der Erforschung von MR stattfindet,
ist diese Strategie aufgrund von kleinen Familien und seltener
Blutsverwandtschaft der Eltern kaum einsetzbar. Um die molekularen Ursachen
autosomal rezessiver MR (ARMR) systematisch zu entschlüsseln, um als
Grundvoraussetzung für Diagnose, Beratung und Therapie zu dienen, haben wir
den Fokus auf große, blutsverwandte iranische Familien gelegt. In unseren
Forschungen zu den molekularen Ursachen von ARMR haben wir neue ARMR-Loci
identifiziert, doch sind darunter sechs Hot Spot-Loci für unspezifische oder
nicht syndromaleARMR(NS-ARMR). Daraus kann geschlossen werden, dass zumindest
in der iranischen Bevölkerung nicht alle Gendefekte selten sind und dass die
Möglichkeit gemeinsamer molekularer Ursachen von NS-ARMR nicht ausgeschlossen
werden kann. Diese Arbeit ist Teil des großen Projekts die molekularen
Ursachen von ARMR zu erforschen. Zwei der sechs Hot Spots für ARMR wurden
untersucht und die zugrunde liegenden Gendefekte identifiziert. Die
Kopplungsintervalle von zwei iranischen Familien mit mehreren von NS-ARMR
betroffenen Patienten überlappen auf Chr19q13.2-q13.31. Im Gen ZNF526 wurden
zwei Missense-Mutationen mit hoher Pathogenitätsvoraussage identifiziert.
ZNF526 kodiert ein Krüppel-Zinkfinger-Protein. Eine dieser Mutationen wurde in
einer weiteren Familie mit NS-ARMR identifiziert, die in der gleichen Stadt im
Nordwesten des Irans wohnt. Weitere Analysen ergaben einen gemeinsamen
Haplotyp beider Familien, die daher entfernt miteinander verwandt sein müssen.
Beide Mutationen betreffen funktionelle Domänen von ZNF526. In silico-
Proteinmodellierung zeigte eine Veränderung der Proteinkonformation, welche
wahrscheinlich die Funktion des Proteins behindert. Eine Minderung der DNA-
Affinität wurde anhand von Chip-seq bestätigt. Spezifische Veränderung des
Genexpressionsmusters in Lymphoblasten der Patienten wurde anhand von Arrays
gezeigt. Dieser Befund konnte in ZNF526-defizienten Neuroblastomzellen
rekapituliert werden. Die Annotation der Genfunktionen zeigte eine
Anreicherung der deregulierten Gene in Singal-und Stoffwechselwegen, die eine
Rolle in der Proteinsynthese, mitochondrialer Dysfunktion, Energiemetabolismus
und Genregulation spielen. Des Weiteren konnten wir die Interaktion von ZNF526
und PRKRIR zeigen, einem Transkriptionsfaktor, welcher sehr spät in der
Primatenevolution entstand. Diese beiden Proteine sind daher sehr viel
versprechende Kandidaten zur Erforschung der Entwicklung und Evolution höherer
Gehirnfunktionen von Primaten. In dieser Arbeit haben wir auch die Gendefekte
in MRT5 aufgedeckt und drei schädliche Mutationen in NSUN2 identifiziert.
Diese Mutationen wurden in zwei nicht miteinander verwandten blutsverwandten
iranischen Familien sowie in einer türkischen Familie identifiziert. Die
Patienten leiden unter NS-ARMR. NSUN2 kodiert eine Methyltransferase, welche
die vom Intron abhängige Bildung von 5-Methylcytosin an das C34 der tRNA-
leu(CAA) katalysiert. Alle Mutationen führen zum Verlust der Proteinfunktion
und verursachen mit allerWahrscheinlichkeit den Phänotyp der Patienten. Um
weitere Beweise für die Beteiligung von NSUN2 an kognitiven Funktionen zu
erhalten, wurden Drosophila-Mutaten untersucht, denen das NSUN2-Ortholog
fehlt. Die Mutanten zeigten deutliche Behinderung des Lernens, was deutlich
die Relevanz von NSUN2 für höhere Gehirnfunktionen betont. Des Weiteren konnte
diese Studie erstmals Mutationen in VLDLR (very low-density lipoprotein
receptor) in Patienten mit Dysäquilibrium-Syndrom identifizieren und die
zentrale Rolle des Rezeptors in der Verursachung der Krankheit bestätigen.
Mutationen in VLDLR wurden auch mit vierfüßiger Fortbewegung in einigen
Familien assoziiert, die jedoch in unseren Patienten nicht vorhanden ist.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass sowohl NSUN2 als auch ZNF526 zu den wenigen
Genen gehören, die NS-ARMR verursachende Mutationen in mehreren voneinander
unabhängigen Familien tragen. Daraus lässt sich schließen, dass beide Gene zu
den häufiger von Mutationen betroffenen Genen bei NS-ARMR gehören, zumindest
in der iranischen Bevölkerung. Weiter Studien sind nötig, um die
krankheitsverursachenden Mutationen in den anderen vier Hot Spots zu
identifizieren und die Beteiligung der betroffenen Gene an der humanen
Kognition zu erschließen. Diese Untersuchungen werden durch die Exom-
Anreicherung und das Next Generation Sequencing (NGS) erleichtert, welche
kürzlich als kosteneffiziente und schnelle Strategien für das
Mutationsscreening und die Identifizierung von Krankheitsgenen in den
kodierenden Regionen des humanen Genoms eingeführt wurden