Comparison of the cellular and biochemical properties of Plasmodium falciparum choline and ethanolamine kinases.

International audienceThe proliferation of the malaria-causing parasite Plasmodium falciparum within the erythrocyte is concomitant with massive phosphatidylcholine and phosphatidylethanolamine biosynthesis. Based on pharmacological and genetic data, de novo biosynthesis pathways of both phospholipids appear to be essential for parasite survival. The present study characterizes PfCK (P. falciparum choline kinase) and PfEK (P. falciparum ethanolamine kinase), which catalyse the first enzymatic steps of these essential metabolic pathways. Recombinant PfCK and PfEK were expressed as His6-tagged fusion proteins from overexpressing Escherichia coli strains, then purified to homogeneity and characterized. Using murine polyclonal antibodies against recombinant kinases, PfCK and PfEK were shown to be localized within the parasite cytoplasm. Protein expression levels increased during erythrocytic development. PfCK and PfEK appeared to be specific to their respective substrates and followed Michaelis-Menten kinetics. The Km value of PfCK for choline was 135.3+/-15.5 microM. PfCK was also able to phosphorylate ethanolamine with a very low affinity. PfEK was found to be an ethanolamine-specific kinase (Km=475.7+/-80.2 microM for ethanolamine). The quaternary ammonium compound hemicholinium-3 and an ethanolamine analogue, 2-amino-1-butanol, selectively inhibited PfCK or PfEK. In contrast, the bis-thiazolium compound T3, which was designed as a choline analogue and is currently in clinical trials for antimalarial treatment, affected PfCK and PfEK activities similarly. Inhibition exerted by T3 was competitive for both PfCK and PfEK and correlated with the impairment of cellular phosphatidylcholine biosynthesis. Comparative analyses of sequences and structures for both kinase types gave insights into their specific inhibition profiles and into the dual capacity of T3 to inhibit both PfCK and PfEK

Choline et éthanolamine kinases chez Plasmodium falciparum (Caractérisation biochimique et cellulaire des enzymes et de leur activité)

Le développement de Plasmodium falciparum, agent du paludisme, est indissociable d une production considérable de membranes par le parasite. Les biosynthèses de phosphatidylcholine (PC) et de phosphatidyléthanolamine (PE), principaux constituants de ces membranes, sont essentielles à la croissance du parasite durant son développement intraérythrocytaire. Les travaux de cette thèse ont eu pour objectifs la caractérisation des premières enzymes des voies de synthèse de novo de PC et de PE chez P. falciparum, soit respectivement la choline kinase (PfCK) et l éthanolamine kinase (PfEK). Les paramètres cinétiques ont été déterminés sur les enzymes recombinantes purifiées et sur les kinases endogènes. La PfCK et la PfEK paraissent spécifiques de leur substrat respectif, à savoir la choline ou l éthanolamine. Nous avons étudié l inhibition des kinases par des composés analogues de substrat et par une nouvelle molécule antipaludique T3/SAR97276A. Chacune de ces enzymes est inhibée spécifiquement par l analogue de substrat. D autre part, T3, bien que conçu comme un analogue de choline, apparaît être un inhibiteur compétitif de la PfCK mais également de la PfEK. Nous avons immunisé des souris avec les protéines recombinantes purifiées. Au moyen des séra polyclonaux murins reconnaissant spécifiquement la PfCK ou la PfEK, nous avons montré que ces kinases sont localisées dans le cytoplasme de P. falciparum et sont exprimées à chaque stade du cycle intra-érythrocytaire. Nous avons également caractérisé des souches plasmodiales transgéniques surexprimant la PfCK ou de la PfEK, afin de déterminer l impact des composés inhibiteurs sur la croissance intra-érythrocytaire de P. falciparumMONTPELLIER-BU Pharmacie (341722105) / SudocSudocFranceF

Caractérisations biochimique et cellulaire de la choline et de l éthanolamine kinase de Plasmodium falciparum

Le développement de Plasmodium falciparum, agent du paludisme, est indissociable d une production considérable de membranes par le parasite. Les biosynthèses de phosphatidylcholine (PC) et de phosphatidyléthanolamine (PE), principaux constituants de ces membranes, sont essentielles à la croissance du parasite au cours de son développement intraérythrocytaire, phase durant laquelle sont observés les symptômes cliniques de la maladie. Les travaux de cette thèse ont eu pour objectifs la caractérisation des premières enzymes des voies de synthèse de novo de PC et de PE chez P. falciparum, soit respectivement la choline kinase (PfCK) et l éthanolamine kinase (PfEK). Les paramètres cinétiques ont été déterminés sur les kinases recombinantes exprimées en système bactérien puis purifiées. La PfCK et la PfEK paraissent spécifiques de leur substrat respectif, à savoir la choline et l éthanolamine. Nous avons étudié l inhibition des kinases recombinantes par des composés analogues de substrat et par une nouvelle molécule antipaludique T3/SAR97276A, actuellement en essais cliniques de phase II. Chacune de ces enzymes est inhibée spécifiquement par l analogue de substrat. D autre part, T3, bien que conçu comme un analogue de choline, apparaît être un inhibiteur compétitif de la PfCK mais également de la PfEK. Nous avons immunisé des souris avec les protéines recombinantes purifiées. Au moyen des séra polyclonaux murins reconnaissant spécifiquement la PfCK ou la PfEK, nous avons montré que ces kinases sont localisées dans le cytoplasme de P. falciparum et sont exprimées à tous les stades du cycle érythrocytaire de ce parasite, particulièrement au stade matureMONTPELLIER-BU Pharmacie (341722105) / SudocSudocFranceF

Biochemical characterization of Plasmodium falciparum CTP:phosphoethanolamine cytidylyltransferase shows that only one of the two cytidylyltransferase domains is active

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