The role of ICBP90 in T cell regulating mechanisms

La stimulation du récepteur TCR (T Cell Receptor) aboutit à des programmes génétiques capables à la fois d'activer ou de réprimer diverses fonctions du lymphocyte T. Dans les lymphocytes T pré-activés, la stimulation du TCR arrête le cycle cellulaire en phase G1 et conduit les cellules à une apoptose nommée AICD (Activation-Induced Cell Death). Ce phénomène est fondamental dans la régulation du système immunitaire. L'ICBP90 (Inverted CCAAT box Binding Protein of 90 kDa) appartient à une nouvelle famille de protéines nucléaires impliquées dans la régulation du cycle cellulaire et en particulier la transition G1/S. Cette transition est une étape obligatoire à l'entrée des lymphocytes T en phase de prolifération. S'ils ne parviennent pas à la franchir, ils seront " condamnés à mort ".Dans ce travail, nous avons confirmé d'abord le rôle régulateur de l'ICBP90 dans la transition G1/S au cours du cycle cellulaire des cellules normales. Cette régulation, faisant intervenir la phosphorylation de l'ICBP90 par la PKA (Protein Kinase A), est défaillante dans le cycle cellulaire des cellules tumorales. De plus, l'ICBP90 est une protéine anti-apoptotique dont l'expression est inhibée lors de l'apoptose, sa surproduction pourrait être une stratégie utilisée par les cellules tumorales pour échapper aux processus apoptotiques de contrôle avant le passage en G1/S.La voie pRb (Protein of Retinoblastoma)/E2F est le véritable allié de l'ICBP90 pour la régulation du cycle cellulaire. En effet, l'interaction entre l'ICBP90 et cette voie est observée à différents niveaux. De plus, cette voie est impliquée dans l'arrêt du cycle cellulaire en phase G1 observé dans les lymphocytes T après stimulation du TCR. Cette stimulation induit également une diminution de l'expression de l'ICBP90 faisant intervenir le complexe inhibiteur pRb/E2F. L'absence de l'ICBP90, d'une part empêche l'expression des gènes impliqués dans la transition G1/S, et d'autre part favorise l'expression des gènes pro-apoptotiques. Ceci est probablement lié à l'intervention des processus du remodelage de la chromatine. Finalement, les lymphocytes T sont conduits à un arrêt en phase G1 suivi par des phénomènes apoptotiques. L'ensemble de ces études devrait permettre d'apporter de nouvelles connaissances concernant les mécanismes de régulation des lymphocytes T.Pas de résum

The role of ICBP90 in T cell regulating mechanisms

La stimulation du récepteur TCR (T Cell Receptor) aboutit à des programmes génétiques capables à la fois d'activer ou de réprimer diverses fonctions du lymphocyte T. Dans les lymphocytes T pré-activés, la stimulation du TCR arrête le cycle cellulaire en pPas de résum

Rôle de l’ICBP90 dans les Mécanismes de Régulation des Lymphocytes T

La stimulation du récepteur TCR (T Cell Receptor) aboutit à des programmes génétiques capables à la fois d’activer ou de réprimer diverses fonctions du lymphocyte T. Dans les lymphocytes T pré-activés, la stimulation du TCR arrête le cycle cellulaire en phase G1 et conduit les cellules à une apoptose nommée AICD (Activation-Induced Cell Death). Ce phénomène est fondamental dans la régulation du système immunitaire. L’ICBP90 (Inverted CCAAT box Binding Protein of 90 kDa) appartient à une nouvelle famille de protéines nucléaires impliquées dans la régulation du cycle cellulaire et en particulier la transition G1/S. Cette transition est une étape obligatoire à l’entrée des lymphocytes T en phase de prolifération. S’ils ne parviennent pas à la franchir, ils seront « condamnés à mort ». Dans ce travail, nous avons confirmé d’abord le rôle régulateur de l’ICBP90 dans la transition G1/S au cours du cycle cellulaire des cellules normales. Cette régulation, faisant intervenir la phosphorylation de l’ICBP90 par la PKA (Protein Kinase A), est défaillante dans le cycle cellulaire des cellules tumorales. De plus, l’ICBP90 est une protéine anti-apoptotique dont l’expression est inhibée lors de l’apoptose, sa surproduction pourrait être une stratégie utilisée par les cellules tumorales pour échapper aux processus apoptotiques de contrôle avant le passage en G1/S. La voie pRb (Protein of Retinoblastoma)/E2F est le véritable allié de l’ICBP90 pour la régulation du cycle cellulaire. En effet, l’interaction entre l’ICBP90 et cette voie est observée à différents niveaux. De plus, cette voie est impliquée dans l’arrêt du cycle cellulaire en phase G1 observé dans les lymphocytes T après stimulation du TCR. Cette stimulation induit également une diminution de l'expression de l'ICBP90 faisant intervenir le complexe inhibiteur pRb/E2F. L’absence de l’ICBP90, d’une part empêche l'expression des gènes impliqués dans la transition G1/S, et d’autre part favorise l’expression des gènes pro-apoptotiques. Ceci est probablement lié à l’intervention des processus du remodelage de la chromatine. Finalement, les lymphocytes T sont conduits à un arrêt en phase G1 suivi par des phénomènes apoptotiques. L’ensemble de ces études devrait permettre d’apporter de nouvelles connaissances concernant les mécanismes de régulation des lymphocytes T. TCR (T Cell Receptor) engagement leads to genetic programs that both activate and inhibit T cell functions. In pre-activated T cells, TCR stimulation induces cell cycle arrest in G1 phase and leads cells to apoptosis, called AICD (Activation-Induced Cell Death). This phenomenon is fundamental in the immune system regulation. ICBP90 (Inverted CCAAT box Binding Protein of 90 kDa) is a member of a new family of nuclear proteins implicated in the cell cycle regulation, particularly during the G1/S transition. This barrier is the obligatory gate that T cells should traverse to enter proliferation. If they do not, they will be condemned to death. In this work, we started by confirming the regulatory role of ICBP90 during the transition G1/S in normal cell cycle. This role which seems to be controlled in part through ICBP90 phosphorylation by PKA (Protein Kinase A), is missing in cancer cell cycle. Moreover, ICBP90 is an anti-apoptotic protein that is inhibited in apoptosis and its overexpression could be a strategy for cancer cells to escape from elimination by apoptotique processes before the passage G1/S. The pRb (Protein of Retinoblastoma)/E2F pathway appears to be a partner of ICBP90 during the cell cycle regulation. Interaction between ICBP90 and this pathway can be observed at various levels. This pathway can be the explanation for G1 phase arrest of the cell cycle observed after TCR stimulation in pre-activated T cells. This stimulation also induces down regulation of ICBP90 expression in which the inhibitory pRb/E2F complex is the main actor. The absence of ICBP90 in activated T cells prevents the expression of the G1/S regulating genes and, at the same time, enhances the expression of pro-apoptotic genes. This is probably by implicating chromatin remodelling processes. Finally, T cells are forced to undergo a G1 phase arrest followed by AICD. The present study should bring promising knowledge concerning T cell regulating mechanisms

Rôle de l'ICBP90 dans les mécanismes de régulation des lymphocytes T

La stimulation du récepteur TCR (T Cell Receptor) aboutit à des programmes génétiques capables à la fois d'activer ou de réprimer diverses fonctions du lymphocyte T. Dans les lymphocytes T pré-activés, la stimulation du TCR arrête le cycle cellulaire en phase G1 et conduit les cellules à une apoptose nommée AICD (Activation-Induced Cell Death). Ce phénomène est fondamental dans la régulation du système immunitaire. L'ICBP90 (Inverted CCAAT box Binding Protein of 90 kDa) appartient à une nouvelle famille de protéines nucléaires impliquées dans la régulation du cycle cellulaire et en particulier la transition G1/S. Cette transition est une étape obligatoire à l'entrée des lymphocytes T en phase de prolifération. S'ils ne parviennent pas à la franchir, ils seront "condamnés à mort".Dans ce travail, nous avons confirmé d'abord le rôle régulateur de l'ICBP90 dans la transition G1/S au cours du cycle cellulaire des cellules normales. Cette régulation, faisant intervenir la phosphorylation de l'ICBP90 par la PKA (Protein Kinase A), est défaillante dans le cycle cellulaire des cellules tumorales. De plus, l'ICBP90 est une protéine anti-apoptotique dont l'expression est inhibée lors de l'apoptose, sa surproduction pourrait être une stratégie utilisée par les cellules tumorales pour échapper aux processus apoptotiques de contrôle avant le passage en G1/S.La voie pRb (Protein of Retinoblastoma)/E2F est le véritable allié de l'ICBP90 pour la régulation du cycle cellulaire. En effet, l'interaction entre l'ICBP90 et cette voie est observée à différents niveaux. De plus, cette voie est impliquée dans l'arrêt du cycle cellulaire en phase G1 observé dans les lymphocytes T après stimulation du TCR. Cette stimulation induit également une diminution de l'expression de l'ICBP90 faisant intervenir le complexe inhibiteur pRb/E2F. L'absence de l'ICBP90, d'une part empêche l'expression des gènes impliqués dans la transition G1/S, et d'autre part favorise l'expression des gènes pro-apoptotiques. Ceci est probablement lié à l'intervention des processus du remodelage de la chromatine. Finalement, les lymphocytes T sont conduits à un arrêt en phase G1 suivi par des phénomènes apoptotiques. L'ensemble de ces études devrait permettre d'apporter de nouvelles connaissances concernant les mécanismes de régulation des lymphocytes T.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Sequencing and Gene Expression Analysis of Leishmania tropica LACK Gene

Background: Leishmania Homologue of receptors for Activated C Kinase(LACK) antigen is a 36-kDa protein, which provokes a very early immune response against Leishmania infection. There are several reports on the expression of LACK through different life-cycle stages of genus Leishmania, but only a few of them have focused on L.tropica. Methods: The present study provides details of the cloning, DNA sequencing and gene expression of LACK in this parasite species. First,several local isolates of Leishmania parasites were typed in our laboratory using PCR technique to verify of Leishmania parasite species. After that,LACK gene was amplified and cloned into a vector for sequencing. Finally,the expression of this molecule in logarithmic and stationary growth phase promastigotes, as well as in amastigotes, was evaluated by Reverse Transcription-PCR (RT-PCR) technique. Results: The typing result confirmed that all our local isolates belong to L.tropica. LACK gene sequence was determined and high similarity was observed with the sequences of other Leishmania species. Furthermore,the expression of LACK gene in both promastigotes and amastigotesforms was confirmed. Conclusion: Overall, the data set the stage for future studies of the properties and immune role of LACK gene products

Purification of polyclonal IgG specific for Camelid’s antibodies and their recombinant nanobodies

Camelid’ s heavy-chain antibody (HCAb) consists of only two heavy chains and lacks the two light chains together with the CH1 domain usually found in conventional immunoglobulins. A recombinant single antigen-binding entity, named VHH (or Nanobody®) was generated by reengineering the variable domains from HCAb. This study focuses on the detection of camelid´s immunoglobulins as well as their derivative nanobodies using a universal anti-camel antibody produced in rabbit (rIgG). Starting from a crude rabbit serum, a standard stock of rIgG (1 mg/ml) was prepared after purification by affinity chromatography using protein-A column. As expected, rIgG was able to detect camel antibodies in ELISA and immunoblotting, and its reactivity was equal against all different camel IgG subclasses, which were purified from serum by differential affinity chromatography on protein-G and -A. Interestingly, rIgG also recognized nanobodies since they were originally part of camel HCAbs, providing an alternative method to detect the corpus of these recombinant proteins rather than targeting their artificial tags. These data suggest that the anti-camel rIgG described here could be efficiently applied at different stages of nanobody technology, including the quantitation of the issued nanobodies and their detection when bound to target antigens

Exploiting Nanobodies in the Detection and Quantification of Human Growth Hormone via Phage-Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

BackgroundMonitoring blood levels of human growth hormone (hGH) in most children with short stature deficiencies is crucial for taking a decision of treatment with extended course of daily and expensive doses of recombinant hGH (rhGH or Somatropin®). Besides, misusing of rhGH by sportsmen is banned by the World Anti-Doping Agency and thus sensitive GH-detecting methods are highly welcome in this field. Nanobodies are the tiniest antigen-binding entity derived from camel heavy chain antibodies. They were successfully generated against numerous antigens including hormones.MethodsA fully nanobody-based sandwich ELISA method was developed in this work for direct measurement of GH in biological samples.ResultsTwo major characteristics of nanobody were exploited for this goal: the robust and stable structure of the nanobody (NbGH04) used to capture hGH from tested samples, and the great ability of tailoring, enabling the display of the anti-GH detector nanobody (NbGH07) on the tip of M13-phage. Such huge, stable, and easy-to-prepare phage-Nb was used in ELISA to provide an amplified signal. Previously, NbGH04 was retrieved on immobilized hGH by phage display from a wide “immune” cDNA library prepared from a hGH-immunized camel. Here, and in order to assure epitope heterogeneity, NbGH07 was isolated from the same library using NbGH04-captured hGH as bait. Interaction of both nanobodies with hGH was characterized and compared with different anti-GH nanobodies and antibodies. The sensitivity (~0.5 ng/ml) and stability of the nanobody-base sandwich ELISA were assessed using rhGH before testing in the quantification of hGH in blood sera and cell culture supernatants.ConclusionIn regard to all advantages of nanobodies; stability, solubility, production affordability in Escherichia coli, and gene tailoring, nanobody-based phage sandwich ELISA developed here would provide a valuable method for hGH detection and quantification

Characterization of Annexin V Fusion with the Superfolder GFP in Liposomes Binding and Apoptosis Detection

Programed cell death is a critical and unavoidable part of life. One of the most widely used markers for dying cells, by apoptosis or pyroptosis, is the redistribution of phosphatidylserine (PS) from the inner to the outer plasma membrane leaflet. Annexin V protein is a sensitive and specific probe to mark this event because of its high affinity to the exposed PS. Beyond that, annexin V can bind to any PS-containing phospholipid bilayer of almost all tiny forms of membranous vesicles like blood platelets, exosomes, or even nanostructured liposomes. In this work, recombinant human annexin V was produced as a fusion with a highly fluorescent superfolder derivative of the green fluorescent protein (sfGFP) in Escherichia coli. The fusion protein(sfGFP-ANXV, 64 kDa), annexin V (ANXV, 40 kDa), and sfGFP (27 kDa) were separately produced after cloning their encoding genes in pRSET plasmid, and all proteins were expressed in a soluble form, then purified in high yields because of their N-terminal 6× His tag (~150 mg of pure protein per 1 L culture). Superiority of this fluorescent fusion protein over fluorescein-conjugated annexin V was demonstrated in binding to phospholipids (and their liposomes), prepared from natural sources (soya bean and egg yolk) that have different content of PS, by using different methods including ELISA, dot-blotting, surface plasmon resonance, and flow cytometry. We also applied fluorescent annexin V in the detection of apoptotic cells by flow cytometry and fluorescent microscopy. Interestingly, sfGFP-ANXV fusion was more sensitive to early apoptotic stressed HeLa cells than fluorescein-conjugated-ANXV. This highly expressed and functional sfGFP-ANXV fusion protein provides a promising ready-to-use molecular tool for quantifying liposomes (or similarly exosomes) and detecting apoptosis in cells