약물대사체학을 이용한 진세노사이드 Rk1의 항혈소판 작용 기전 관련 대사체 규명

학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 약학과, 2013. 2. 권성원.혈소판은 혈관 손상 및 출혈이 생기는 경우 활성화 되어 지혈작용에 중요한 역할을 하는 세포로서, 과도한 지혈 작용에 의해 생긴 혈전(thrombus)으로부터 혈액 순환 장애 및 심근 경색증, 뇌졸중 등 다양한 질환을 유발한다. 최근 심혈관질환 발병율이 증가하고 있으며, 혈소판의 응고기전을 억제시키는 약물의 개발 및 기전연구는 심혈관계 질환 치료제 개발에 매우 유용하다고 할 수 있다. 약물대사체학(Pharmacometabolomics)은 세포, 조직, 혹은 생체액 속에 포함되어 있는 저분자량 물질인 대사체 (metabolite)를 그 대상으로 하는 대사체학 중 하나로서, 약물에 의해 변화된 많은 대사체를 동시에 관찰하고, 대사체들 간의 관계를 설명하는 학문이라 할 수 있다. 동시에 관찰되는 많은 대사체의 변화는 통계적 기법을 이용하여 해석할 수 있으며, 변화된 대사체를 통하여 약물기전 연구에 중용한 정보를 제공하고, 판별 분석 모델링을 통하여 질병상태의 예측 또는 약물 반응의 예후 예측에 대한 가능성을 제시하고 있다. 이에 본 연구에서는, arachidonic acid에 의하여 유도되는 혈소판 응집작용에 대한 진세노사이드 Rk1의 작용기전 연구를 약물대사체학을 통해 수행하고자 하였다. 혈소판 내의 metabolites profiling은 UPLC/Q-TOF를 이용하여 실시하였으며, 수집된 데이터는 Profile analysis software에 의해 버켓팅(Bucketing) 되었다. 주성분분석 (Principal component analysis PCA) 및 판별 분석 (Partial least square discriminant analysis, PLS-DA)은 SIMCA-P (v 12.0)를 이용하여 수행되었으며, 판별 분석을 통해 그룹간의 차이를 규명할 수 있는 대사체를 효과적으로 판별 할 수 있었다. 혈소판이 응집된 샘플과 진세노사이드 Rk1이 처리된 샘플 군에서 12(S)-Hydroxyeicosatetradecaenoic acid (12(S)-HETE) 가 유의성 있게 감소된 것을 확인 할 수 있었으며, 이는 positive control로 사용했던 아스피린 처리군 과도 구별되는 대사체임을 확인 하였다. 반면, Thromboxane B2의 경우 아스피린 처리 군과 구별되지 않음을 확인 할 수 있었다. 이에, 진세노사이드 Rk1의 항혈소판 작용은 TXB2의 생성을 억제하는 아스피린의 작용기전에도 관여하며, 12(S)-HETE의 생성기전이 항혈소판 응집작용에 기여하는 것으로 확인 하였다. 또한, 본 실험에서는 진세노사이드 Rk1이 세포 내 칼슘 유리 및 외부로부터의 칼슘 유입을 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다. 이에, 칼슘 농도변화와 12-LOX의 연계성을 확인하였고, 12-HETE의 생성은 칼슘의 농도변화가 12-LOX의 translocation에 영향을 미침으로써 나타내는 현상으로 판단하였다.국문초록 ………………………………………………………… i 목차 …………………………………………………………… iii List of Figures ……………………………………………… vi List of Tables ………………………………………………… viii List of Abbreviations …………………………………………… ix Ⅰ. 서 론 ………………………………………………………………… 1 1. 약물대사체학 …………………………………………………………… 1 1-1. 약물대사체학의 의의 및 목적……………………… 1 1-2. 주성분 분석 및 판별 분석 ……………………………… 3 2. 혈소판의 생리 및 활성화 ………………………………… 5 3. Ginsenoside Rk1의 항혈소판 작용 ……………………… 8 Ⅱ. 실 험 방 법 ……………………………………………… 11 1. 실험 재료, 시약 및 기기 ………………………………… 11 1-1. 재료 및 시약 …………………………………………… 11 1-2. 실험 동물 ……………………………………………… 11 1-3. 실험 기기…………………………………………………… 12 2. Ginsenoside Rk1의 분리 ………………………………… 13 2-1. 가공인삼 (Sun ginseng, SG)의 제조 ………………… 13 2-2. Ginsenoside Rk1의 분리 ……………………………… 13 3. Ginsenoside Rk1의혈소판응집억제 활성 ……………… 14 3-1. Washed platelets (WP)의 제조 ………………………… 14 3-2. 혈소판응집억제활성 ……………………………………… 14 4. UPLC/Q-TOF MS 분석방법의 검증 …………………… 17 4-1. 분석조건 ………………………………………………… 17 4-2. 분석법 검증 (Method validation)……………………… 18 5. 혈소판 내의 대사체 분석 …………………………………… 19 5-1. 분석조건 ………………………………………………… 19 5-2. 분석샘플 제조 …………………………………………… 19 6. 데이터 수집 및 처리 ………………………………………… 21 7. 다변량 분석 …………………………………………… 22 8. Cyclooxygenase (COX) 활성…………………………… 23 8-1. COX 활성의 검정 ……………………………………… 23 8-2. 통계적 처리법 …………………………………………… 23 9. 혈소판 내 calcium 변화 측정……………………………… 24 10. Western blot analysis …………………………………… 25 Ⅲ. 결과 및 고찰 …………………………………………… 27 1. Ginsenoside Rk1의 항혈소판 응집작용 ………………… 27 2. 시스템 불순물 분석 및 제거………………………………… 28 3. UPLC/Q-TOFMS 분석법 검증 …………………………… 30 4. UPLC/Q-TOFMS를 이용한 대사체 분석 ………………… 34 5. 주성분 분석 및 판별분석 ………………………………… 41 6. Eicosanoids 및 TXB2 생성억제 효과 …………………… 46 7. Cyclooxygenase (COX) 저해 활성……………………… 48 8. 혈소판 내 calcium 농도 측정……………………………… 51 9. 12-Lipoxygenase (12-LOX)의 translocation ………… 53 Ⅵ. 결 론 …………………………………………………… 54 Ⅴ. 참 고 문 헌 ………………………………………………… 57 Abstract ……………………………………………………… 62Docto