사이트 지정 열역학 분석 방법: 단백질 폴딩 연구 및 용매화 모델 평가

학위논문(박사) -- 서울대학교대학원 : 자연과학대학 화학부, 2023. 8. 신석민.단백질 접힘은 수성 환경에 크게 의존합니다. 용매화가 단백질 접힘에 미치는 영향은 널리 연구되어 왔지만 접힘 안정성이 용매화에 의해 제어되는 정도는 개별 아미노산 수준에서 명확하지 않습니다. 여기에서 우리는 단백질의 각 백본과 측쇄에 대한 접힘 자유 에너지 요소를 평가하기 위해 사이트 지정 열역학 분석 방법을 사용합니다. 따라서 대표적인 -시트 및 -나선 단백질의 각 중요 부위에서 시스템에 물리적 변형을 도입하지 않고 접힘 안정성 기여도를 정량적으로 측정합니다. 인간 Pin WW 도메인 단백질 및 빌린 헤드피스 서브도메인 단백질 각각의 접힘 현상에 대한 수십 μs 길이의 분자 역학 시뮬레이션으로부터의 열역학적 결과가 보고됩니다. 결과로는 Pin WW의 접힘 자유 에너지는 –4.9 kcal/mol이었으며, 이는 기존 실험 결과 보고와 흡사했습니다. 용매화 자유 에너지 및 진공 상태의 단백질 에너지의 분해 방법을 단일 아미노산 분해능에 통합함으로써 단백질 안정성을 지배하는 수소 결합 및 소수성 상호 작용과 같은 기본 분자 상호 작용의 에너지 결과를 결정합니다. 사이트 지정 열역학 방법의 적용은 두 모델 단백질의 열역학적 안정성에 대한 명시적 및 암시적 용매화 모델의 영향을 비교하기 위해 확장됩니다. 열역학 분석은 종종 명시적 또는 암시적 물 모델을 사용하는 분자 역학 시뮬레이션을 사용하여 많은 수의 원자적 형태를 샘플링하여 수행됩니다. 서로 다른 용매화 모델의 열역학적 결과가 분자 수준에서 어느 정도 신뢰할 수 있는지는 불확실합니다. 여기서 우리는 단일 백본 및 측쇄 분해능에서 폴딩 안정성에 대한 두 용매화 모델의 영향을 정량화합니다. TIP3P 용매 및 일반화된 Born/표면적 용매 모델에서 생성된 시뮬레이션 궤적을 사용하여 위에서 설명한 두 단백질의 잔류물 특정 폴딩 자유 에너지 구성 요소를 평가합니다. 일반화 된 Born 용매의 열역학적 불일치는 대부분 양성 측쇄에서 비롯된 다음 불안정한 소수성 측쇄에서 비롯된 것으로 나타났습니다. 대조적으로, 두 단백질의 백본 잔기 기여도는 비슷했다. 우리의 연구는 단백질 시뮬레이션의 맥락에서 용매 모델의 상세한 열역학적 평가의 토대를 마련합니다.Folding of a protein depends heavily on its aqueous environment. How solvation affects protein folding has been widely studied, but the extent to which folding stability is controlled by the solvation is unclear at the individual amino acid level. In this dissertation, we report the results of protein folding studies that employ the site-directed thermodynamic analysis method to assess the folding free energy components for each backbone and side chain of proteins. Thermodynamic results from tens of µs-length molecular dynamics simulations of the folding phenomenon of each of the representative -sheet and -helical proteins, human Pin WW domain protein and the villin headpiece subdomain are reported, respectively. We provide a quantitative measure of folding stability contributions from each of the critical sites of two model proteins, without introducing physical modifications to the system as in site-directed mutagenesis methods. Moreover, the resulting folding free energy of Pin WW was 4.9 kcal/mol, within the error bound of experimental reporting of 3.4 kcal/mol. By incorporating the decomposition method of solvation free energy and gas-phase potential energy into single amino acid resolution, we determine the energetic consequence of basic molecular interactions such as hydrogen bonding and hydrophobic interaction that govern protein stability. The application of the site-directed thermodynamic method is then extended to compare the influence of explicit and implicit solvation models on thermodynamic stability of the two model proteins. Thermodynamic analysis is often carried out by sampling a large number of atomistic conformations using molecular dynamics simulations that use either an explicit or implicit water model. However, it remains unclear to what extent thermodynamic results from different solvation models are reliable at the molecular level. Here, we quantify the influence of both solvation models on folding stability at single backbone and side chain resolution. Using simulation trajectories resultant from TIP3P solvent and the generalized Born/surface area solvent models, we assess the residue-specific folding free energy components of the two proteins described above. We find that the thermodynamic discrepancy from the generalized Born solvent mostly originates from positive side chains, followed by under-stabilized hydrophobic ones. In contrast, the backbone residue contributions in both proteins were comparable. Our study lays out the foundation for a detailed thermodynamic assessment of solvent models in the context of protein simulation.ABSTRACT iii TABLE OF CONTENTS v LIST OF FIGURES vii LIST OF TABLES ix Chapter 1. Introduction 1 Chapter 2. Site-Specific Backbone and Side-Chain Contributions to Thermodynamic Stabilizing Forces 6 2.1. Methods 7 2.1.1. Folded-State Simulations 7 2.1.2. Unfolded-State Simulations 7 2.1.3. Structural Analysis 8 2.1.4. Thermodynamic Analysis 9 2.1.5. Site-directed Thermodynamic Analysis 9 2.1.6. Error Analysis 10 2.2 Results and Discussions 11 2.2.1. Structural Differences between the Folded and Unfolded States of WW Domain 11 2.2.2. Folding Free Energy of Pin WW 15 2.2.3. Site-Specific Stabilizing Forces 18 Chapter 3. Comparing the Influence of Explicit and Implicit Solvation Models on Site-Specific Thermodynamic Stability of Two Model Proteins 25 3.1. Methods 26 3.1.1. GBSA Solvent MD Simulation of Folded and Unfolded States 26 3.1.2. Structural Analyses 27 3.1.3. Site-Specific Thermodynamic Analyses 28 3.2. Results and Discussions 30 3.2.1. Secondary Structure Preference 32 3.2.2. Hydrophobic Cluster Preference 36 3.2.3. Salt Bridge Preference 40 3.2.4. Generalization to Other Proteins 45 Chapter 4. Conclusion 48 SUPPLEMENTARY INFORMATION 50 Bibliography 73 국문초록 80박

대인존재감의 역할을 중심으로

학위논문(석사) -- 서울대학교대학원 : 사회과학대학 심리학과, 2023. 2. 이훈진.대인외상은 인간관계에서 경험하는 외상적 사건이며, 우울과 사회불안 등의 심리적 부적응 증상을 유발한다고 알려져 있다. 그렇지만 대인외상 경험이 이후 우울 및 사회불안의 경과에 미치는 영향에 대한 연구는 부족한 실정이며, 그 과정에서 어떠한 심리적 요인들이 어떻게 기능하는지에 대한 연구는 더욱 부족한 실정이다. 이에 본 연구에서는 대인외상 경험과 지각된 사회적 지지가 우울 및 사회불안의 경과에 영향을 미치는 과정에서 대인존재감의 역할을 검증하였으며, 대인외상을 경험한 대학생의 대인존재감 수준을 향상시키기 위한 대인존재감 글쓰기 개입의 효과를 사회적 지지 글쓰기 개입과 비교하여 검증하였다. 연구 1에서는 대학생 86명을 대상으로 대인외상 경험, 지각된 사회적 지지, 대인존재감, 우울 및 사회불안을 측정하는 질문지를 이용하여 2주 간격으로 총 3회 설문을 실시하였다. 분석 결과, 대인외상 경험과 지각된 사회적 지지는 상호 독립적으로 우울 및 사회불안의 경과에 영향을 주었다. 대인존재감은 지각된 사회적 지지가 우울 및 사회불안의 경과에 영향을 미치는 과정을 매개하는 것으로 나타났으며, 구체적으로 대인외상 경험 직후의 지각된 사회적 지지가 이후 1개월간 우울 및 사회불안의 경과에 영향을 미치는 과정을 대인외상 경험 직후의 대인존재감이 매개하는 것으로 나타났다. 특히, 높은 대인외상 집단에서는 지각된 사회적 지지가 우울 및 사회불안에 영향을 미치는 과정 모두를 대인존재감이 매개하였으나, 낮은 대인외상 집단에서는 지각된 사회적 지지가 사회불안에 영향을 미치는 과정만을 대인존재감이 매개하였다. 연구 2에서는 1개월 이내에 상당한 수준의 주관적 고통을 수반하는 대인외상 사건을 1번 이상 경험한 대학생 15명을 대인존재감 글쓰기 집단과 사회적 지지 글쓰기 집단에 무선 할당하였고, 연구 참여자들은 5일간 2일 간격으로 총 3회 대인존재감 글쓰기 활동 혹은 사회적 지지 글쓰기 활동을 수행하였다. 분석 결과, 대인존재감 글쓰기 집단은 개입 후 우울 수준이 유의하게 감소하였지만, 사회적 지지 글쓰기 집단은 우울 및 사회불안 수준 모두 유의하게 감소하지 않았다. 다만 우울 및 사회불안의 감소량에 있어서는 두 집단 간 유의한 차이가 없었다. 본 연구는 대인외상 경험과 지각된 사회적 지지가 독립적으로 우울 및 사회불안의 경과에 영향을 미치고, 이 과정에서 대인존재감이 매개효과를 보이며, 대인존재감 글쓰기 개입이 대인외상을 경험한 대학생의 우울 수준을 감소시킨다는 것을 확인하였다는 점에서 의의를 가진다. 마지막으로 본 연구의 한계와 후속 연구에 대한 제언을 논의하였다.Interpersonal trauma is a traumatic event experienced in human relationships, which is known for causing symptoms of psychological maladjustment such as depression and social anxiety. However, there is insufficient research on the effects of interpersonal traumatic experiences on a subsequent course of depression and social anxiety, and there is quite insufficient research on how certain psychological factors function in that process. The present study aimed to investigate the role of mattering in the process in which interpersonal traumatic experiences and perceived social support affect a course of depression and social anxiety, and examine the effectiveness of mattering-writing intervention and social support-writing intervention. In study 1, questionnaires measuring interpersonal traumatic experiences, perceived social support, mattering, depression and social anxiety were administered three times at two weeks intervals to 86 college students. As a result, interpersonal traumatic experiences and perceived social support independently had an effect on a course of depression and social anxiety. Mattering turned out to mediate the process in which perceived social support affected the course of depression and social anxiety, and specifically mattering which is experienced immediately after interpersonal traumatic experiences turned out to mediate the process in which perceived social support which was experienced immediately after interpersonal traumatic experiences affected the subsequent 1-month course of depression and social anxiety. Especially, while mattering mediated both processes in which perceived social support affected depression and social anxiety in high-interpersonal trauma group, mattering mediated only the relationship between perceived social support and social anxiety in low-interpersonal trauma group. In study 2, fifteen college students who experienced more than one considerably painful interpersonal traumatic event randomly assigned to mattering-writing group or social support-writing group, and participants performed mattering-writing activities or social support-writing activities three times at every other days for 5 days. As a result, while depression significantly decreased after the intervention in mattering-writing group, depression and social anxiety did not significantly decrease after the intervention in social support-writing group. However, there was no significant difference in the decrement of depression and social anxiety between two groups. The present study has confirmed that interpersonal traumatic experiences and perceived social support independently affects the course of depression and social anxiety, that mattering mediated the process in which perceived social support affected the course of depression and social anxiety, and that mattering-writing intervention could reduce college students depression who had experienced interpersonal trauma. Finally, limitations of the present study and suggestions for future research were discussed.서 론 1 외상의 정의와 범위 3 대인외상 경험과 우울 및 사회불안 4 대인외상 경험, 지각된 사회적 지지, 대인존재감과우울 및 사회불안의 관계 7 대인존재감 수준 향상을 위한 개입: 글쓰기 처치 13 문제 제기 및 연구 목적 14 연구 1. 대인외상 경험과 지각된 사회적 지지가 우울 및 사회불안의 경과에 영향을 미치는 과정:대인존재감의 역할을 중심으로 17 방법 20 결과 28 논의 55 연구 2. 대인존재감 및 사회적 지지 글쓰기 개입이 대인외상을 경험한 대학생의 우울 및 사회불안에 미치는 영향 61 방법 63 결과 67 논의 70 종합논의 73 참고문헌 81 부 록 93 영문초록 118석

MET 엑손 14 스키핑 돌연변이를 검출하는 엑소좀과 혈소판 풍부 혈장 액상생검 연구

학위논문 (석사) -- 서울대학교 대학원 : 융합과학기술대학원 분자의학 및 바이오제약학과, 2021. 2. 신영기.폐암은 전 세계적으로 발병률과 사망률 모두에서 가장 흔한 암이다. 폐암에는 소세포성 폐암과 비소세포성 폐암의 두 가지 유형이 있다. 비소세포성 폐암은 전체 폐암의 약 85%를 차지하며 예후가 좋지 않다. MET 유전자는 티로신 인산화 수용체를 코딩한다. MET 신호가 비정상적으로 활성화되면 종양화, 세포분화, 종양침입, 혈관신생을 시작하고 유지할 수 있다. 이 전암유전자는 유망한 치료 표적입니다. MET 엑손을 14번 돌연변이는 폐암 환자의 3~4%에서 발견된다. MET 억제제 약물에 대한 반응성을 예측할 수 있는 바이오마커로서 MET 엑손 14 스키핑 돌연변이는 중요하다. MET 엑손 14 스키핑 돌연변이를 가진 환자는 바이오마커 기반으로 하는 캡마티닙 치료가 적용될 수 있다. 따라서, MET 엑손 14 스키핑 돌연변이 검사는 전이성 비소세포성 치료에 중요한 요소이다. 이러한 종류의 동반진단은 캡마티닙 치료에 반응을 하는 전이성 비소세포성 환자를 판단하는 데에 임상적 도움을 주는데 사용된다. 동반진단으로 순환 종양 세포, 순환 종양 DNA, 세포외 소포체, 종양 교육화 혈소판 등이 액상 생검 요소로 사용된다. 엑소좀은 세포외 소포체의 한 종류로 단백질이나 RNA 같은 모세포의 정보를 포함하고 있다. 이러한 엑소좀은 혈소판에 흡수되는 것으로 알려져 있고, 혈소판의 성질을 바꿀 수 있다. 이러한 종양 교육화 혈소판은 암 진단에 중요한 요소가 될 수 있다. 이 연구는 엑소좀이 혈소판으로 흡수되는 경향을 확인하고, 드롭렛 디지털 PCR을 이용하여 MET 엑손 14 스키핑 돌연변이 검출을 위해 혈소판 풍부 혈장을 이용하는 것의 유용성을 확인하는 것을 목적으로 한다. MET 엑손 14 스키핑을 동종으로 발현하는 Hs746T 세포에서 엑소좀이 분리되었다. 렌티바이러스 형질주입에 의해 CD63-GFP가 삽입된 Hs746T에서도 엑소좀을 분리하였다. 먼저 GFP가 붙은 엑소좀을 혈소판과 적혈구에 처리하였다. 둘째로, Hs746T에서 유래한 RNA와 엑소좀을 인간 전혈에 스파이킹 하였다. 6시간 배양 후 혈소판과 적혈구를 형광현미경으로 관찰하였고, RNA가 전혈, 혈장, 혈소판 풍부 혈장으로부터 추출되었다. 추출된 RNA는 cDNA로 합성되었고, MET 엑손 14 스키핑 돌연변이 검출을 각 검체에서 드롭렛 디지털 PCR로 수행하였다. 스파이크 된 엑소좀 RNA가 3296 카피일 때, 456, 532, 72 카피가 혈장, 혈소판 풍부 혈장, 혈소판 부족 혈장에서 각각 검출되었다. GFP가 붙은 엑소좀이 처리된 혈소판에서 형광 신호가 관찰되었다. 형광 신호 차이가 컨트롤에선 0.7873, GFP 엑소좀 처리 혈소판에서는 1.2259로 유의미한 차이가 있었다(p-value < 0.05). 유세포분석을 통해서 GFP 엑소좀 처리 혈소판이 비교군 대비 GFP 신호 이동이 확인되었다. GFP 엑소좀 처리 적혈구에서는 형광 신호에 유의미한 차이가 없었다. RNA 스파이킹 전혈에서는, 전혈, 혈장, 혈소판 풍부 혈장에서 모두 타겟 시퀀스가 검출되지 않았다. 엑소좀 스파이킹 전혈에서는 각 검체에 차이가 있었다. 스파이크 된 엑소좀 RNA가 (MET 엑손 14 스킵) 240 카피일 때, RNA 발현량은 전혈, 혈장, 혈소판에서 각각 0, 7.2, 25.2이었다. MET 엑손 10번 11번에서도 스파이크 된 투입량 대비 검출된 비율이 엑손 14 스키핑과 비슷한 양상을 보였다. 대부분의 엑소좀 RNA는 전혈과 혈장보다 혈소판 풍부 혈장에서 대부분 검출되었다. Hs746T 이종이식 마우스 모델에서, RNA가 엑소좀과 혈소판 풍부 혈장에서 추출되었다. 타겟으로 하는 RNA 시퀀스 20.8 카피가 혈소판 풍부 혈장 검체에서 검출되었다. 결과적으로, 혈소판은 엑소좀과 엑소좀 RNA를 흡수한다. 액상생검에서 혈소판 풍부 혈장은 MET 엑손 14 스키핑 같은 돌연변이 검출을 하는데 유용한 선택이 될 수 있다.Lung cancer is the most common cancer in both incidence and mortality worldwide. There are two main types of lung cancer, small-cell lung carcinoma (SCLC) and non-small-cell lung carcinoma (NSCLC). NSCLC accounts for about 85% of all lung cancers and has a poor prognosis. Mesenchymal-epithelial transition factor (MET) gene encodes receptor tyrosine kinases. When the signals are abnormally activated, it can initiate and maintain tumor transformation, cell proliferation, tumor invasion and angiogenesis. This proto-oncogene is a promising therapeutic target. Mutations leading to MET exon 14 skipping are found in 3-4% of people with lung cancer. MET exon 14 skipping mutation is important as biomarkers that can predict reactivity to MET inhibitor drugs. Patients with MET exon 14 skipping mutation are eligible for biomarker-driven therapy with capmatinib. So, MET exon 14 skipping testing is a critical component in the treatment of mNSCLC. These kinds of companion diagnostics are used to aid clinical decision making to identify mNSCLC patients who are most likely to respond to capmatinib treatment. In companion diagnostics, there are various components for liquid biopsy, including circulating tumor cells (CTCs), circulating tumor DNA (ctDNA), extracellular vesicles (EVs), and tumor-educated platelets (TEPs). Exosomes are a type of extracellular vesicles that contain information about the cells that excrete them such as proteins and RNA. These exosomes are known to be absorbed by platelet and can change property of platelets. These tumor-educated platelets can be an important source of cancer diagnostics. This study aimed to find tendency of platelets absorbing exosomes, and validity of platelet-rich plasma (PRP) analysis for MET exon 14 skipping mutation detection with droplet digital PCR. Exosomes were isolated from cell line (Hs746T) which produces MET exon 14 skipping homogeneously. CD63-GFP tagged exosomes were also generated from Hs746T produced by lentiviral transfection. First, we treated GFP tagged exosome to platelet and RBC. Secondly, we performed spiking the Hs746T-derived RNA and exosomes in human whole blood. After 6 hours incubation, platelets and RBC were taken to fluorescence microscopy and RNA was extracted from whole blood, plasma, and PRP. After Hs746T xenograft mouse model was designed, PRP and exosome were collected for comparison test. We synthesized extracted RNA to cDNA and used droplet digital PCR for detecting MET exon 14 skipping in each sample. When MET exon 14 skipped sequence in spiked exosomal RNA was 3296 copies, there was a difference in plasma, platelet-rich plasma, and platelet-poor plasma (456, 532, and 72 each sample). The fluorescence signal was detected in GFP exosome treated platelets which was not in control platelets. There was a difference in fluorescence intensity; control 0.7873, and GFP exosome treated platelet 1.2259 (p-value 0.5). In RNA spiking whole blood, we cannot detect target sequence in whole blood, plasma, and PRP. In exosome spiking whole blood, there was a difference in each sample. When spiked Exosomal RNA (MET exon 14 skipped) was 240 copies, RNA expression levels from whole blood, plasma, and platelet-rich plasma were 0, 7.2, and 25.2, respectively. In MET exon 10 and 11 sequence, the ratio of input exosome to PRP is approximately similar with target sequence (MET exon 14 skipped); input exosome 1328 and PRP 100. Most of exosomal RNA (MET exon 14 skipped) was detected in PRP than plasma and whole blood. In Hs746T xenograft mouse model, RNA was extracted from exosome and PRP. We can detect 20.8 copies of target RNA sequences (MET exon 14 skipped) only in PRP samples. In conclusion, platelets can uptake spiked exosome and exosomal RNA. In liquid biopsy, platelet-rich plasma can be a useful option for mutation detection like MET exon 14 skipping.Abstract Contents List of Tables List of Figures List of Abbreviations Introduction Materials and Methods Results Discussion Conclusion References 국문 초록Maste