인간 OAT3 를 발현하는 MDCK 세포 시스템 구축 및 상용 약물들과의 약물상호작용 평가

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 약학과, 2013. 2. 정석재.약물수송체 (Drug transporter) 가 약물상호작용 (DDI) 에 중요한 역할을 한다는 것이 많은 연구를 통해 밝혀지고 있다. 그러나 이를 임상적으로 증명하는 것은 시간과 자본이 많이 소요될 뿐 아니라 임상시험에서 인체에 위해성을 유발할 수 있기 때문에 큰 제약이 따른다. 따라서 만약, 신약개발 초기단계에서 약물상호작용을 예측할 수 있다면 신약개발 효율성을 크게 증대시킬 수 있으며 합리적인 신약 후보군을 선택하는데 표준적인 기준을 제공할 수 있다. 이러한 점에서 human transporter 를 발현시킨 in-vitro cell line system 은 합리적인 실험계로 볼 수 있으며 transporter 의 성질에 따라 uptake 또는 transport 실험계를 선택할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 약물상호작용에 큰 영향을 미치는 것으로 알려진 FDA 지정 중요 7 가지 transporter 중, human OAT3 를 선택하여 cloning 하고 이 gene 을 MDCK cell 에 기능을 안정적으로 발현하는 cell line을 구축하였다. RT-PCR 과 function study 를 통해 발현을 확인한 후, 상용화된 8 가지 모델 화합물과의 DDI 평가 실험을 실시하였다. 화합물의 DDI 양상은 문헌과 유사하게 나타났으며, DDI potency 인 IC50 및 transporter 의 Km / Vmax 를 표준적인 동태결과 해석법에 따라 평가하였다. 따라서 본 연구를 통하여 DDI 와 관련된 중요 transporter 인 OAT3 를 cloning 하고 기능적으로 발현하였으며, 향후 본 세포주를 이용하여 특정 물질에 대한 OAT3 경유 DDI 가능성을 신약개발 초기에 screening 할 수 있을 것으로 사료되었다.국문초록 ..................................................................... ii 목 차 ......................................................................... iv 표 목차 ....................................................................... v 그림 목차 ................................................................... vi 1. Introduction ............................................................ １ 1.1. Drug transporter.................................................... １ 1.1.1. OAT3 (SLC22A8) ............................................... １ 1.2. 약물상호작용 (DDI) ............................................... ２ 1.3. In-vitro screening system ..................................... ３ 2. Materials ............................................................... ５ 3. Methods ................................................................ ８ 3.1. Establishment of stable cell line ............................. ８ 3.1.1. Cloning ............................................................ ８ 3.1.2. Subcloning .................................................... １０ 3.1.3. Sequencing ................................................... １１ 3.1.4. Mutagenesis .................................................. １２ 3.1.5. Transfection and selection ............................... １４ 3.1.6. RT-PCR ........................................................ １５ 3.1.7. Function study ............................................... １５ 3.2. DDI screening ....................................................１７ 4. Result ................................................................ １９ 5. Discussion & Conclusion ..................................... ２９ 6. Reference ........................................................... ３２ AbstractMaste

Growth hormone receptor mutation and partial growth hormone insensitivity in children with idiopathic short stature

의과학사업단/박사[한글]특발성 저신장증은 내분비 질환, 염색체이상, 만성질환 등 알려져 있는 저신장증의 원인들이 모두 배제된 저신장증이다. 특발성 저신장증에서 성장호르몬농도는 성장호르몬 결핍증보다는 증가되어 있고 IGF-I 농도는 정상 범위에 있으나 낮은 편에 속한다. 특발성 저신장증에서는 성장호르몬 농도가 정상임에도 불구하고 저신장증을 나타내므로 성장호르몬 수용체의 이상으로 인한 성장호르몬 저항성이 관련되어 있을 것으로 생각되고 있다. 국내에는 특발성 저신장증에서 성장호르몬 저항성에 대한 연구가 없는 상태이다. 본 연구에서는 특발성 저신장증에서 부분적 성장호르몬 저항성의 존재 유무를 조사하고 성장호르몬 저항성이 성장호르몬 수용체 유전자의 이상에서 기인되는지 알아보고자 하였다. 25명의 특발성 저신장증 환아와 30명의 정상 대조군을 대상으로 성장호르몬 수용체 유전자를 분석하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 특발성 저신장증 환아에서 성장호르몬 저항성 평가를 위하여 IGF-I 생성검사를 시행한 결과 IGF-I 농도는 유의한 증가를 보였다. 그러나 IGFBP-3 농도 및 IGF-I과 IGFBP-3 비율은 성장호르몬 투여 전 후에 유의한 차이가 없었다. 성장호르몬 투여에 대한 반응도와 신장표준편차지수변화의 상관성을 볼 때 delta IGF-I의 증가에 따른 delta HTSDS의 증가가 유의하지 않아 IGF-I의 증가에도 불구하고 이에 따른 유의한 성장촉진효과가 관찰되지 않았다. Delta IGFBP-3와 delta HTSDS사이에도 유의한 상관성이 관찰되지 않았다. 이는 특발성 저신장증 환아에서 부분적 성장호르몬 저항성이 존재함을 의미한다. 특발성 저신장증 환아 25명과 정상 대조군 30명에서 성장호르몬 수용체 유전자를 분석한 결과 exon 6상에 있는 168번째 아미노산을 이루는 염기서열 중 세번째 염기 adenine이 guanine으로 치환된 점돌연변이가 존재하는 것을 확인하였으며 합성되는 아미노산은 같은 polymorphism으로 추정되는 소견이었다. 168번째 아미노산의 점돌연변이는 특발성 저신장증 환아들에서 발생빈도가 높은 것으로 알려진 것으로 본 연구에서는 55명 전원에서 guanine으로 확인되어 외국 보고에 비하여 높은 빈도임을 확인하였다. 특발성 저신장증 환아군과 대조군에서 이형접합체가 차지하는 비율은 유의한 차이가 없었다. Exon 10상에 있는 526번째 아미노산을 이루는 첫번째 염기는 adenine과 cytosine 두 가지가 확인되어 우리나라에 L526I 변이형이 존재함을 확인하였다. 특발성 저신장증 환아군과 대조군에서 adenine과 cytosine이 차지하는 비율은 유의한 차이가 없었다. Exon 3과 exon 8상의 돌연변이는 발견되지 않았으나 기존의 서구인에서의 보고와 다른 intron 염기서열을 가지고 있음을 확인하였다. 특발성 저신장증 환아 및 대조군 모두에서 exon 3 근접부 intron의 염기서열에서 하나의 염기 결실이 확인되었고 exon 8 근접부 intron의 염기서열에서 1개 혹은 2개 염기 결실이 5군데에서 확인되었으며 한 곳에서 점돌연변이가 관찰되었다. 이 염기서열은 일본인과 한국인에서 동일하였다. 결론적으로 특발성 저신장증에는 부분적 성장호르몬 저항성이 존재하는 것으로 생각된다. 그러나 부분적 성장호르몬 저항성이 성장호르몬 수용체 유전자의 돌연변이로 설명되지는 못하였다. 특발성 저신장증 환아군과 대조군에서 동일하게 서구인과 다른 염기서열이 존재한다는 사실은 성장호르몬 수용체 유전자의 인종간의 차이를 나타내는 것으로 생각된다. 성장호르몬 수용체의 polymorphism으로 알려져 있는 부위에서 변이형의 빈도가 외국에 비하여 높다는 점은 평균 신장치가 외국과 비교 시 차이를 보인다는 사실과 관련지어 생각될 수 있다. 앞으로 이형접합체를 포함한 이들 성장호르몬 수용체 유전자의 변이형이 성장호르몬 수용체의 기능적 차이와 연관되는지에 대한 규명이 이루어져야 할 것으로 생각된다. [영문]The children with idiopathic short stature are classified on the base of exclusion criteria (dysmorphic features, endocrine diseases, chromosomal abnormalities, malnutrition and underlying systemic illness). Short stature with normal or increased circulating growth hormone and low IGF-I levels indicates that partial growth hormone insensitivity may play a role in idiopathic short stature. As in Laron syndrome which growth hormone receptor defects are responsible for the short stature, some heterozygous defects of the growth hormone receptor gene were reported in idiopathic short stature. The present study was performed to investigate whether partial growth hormone insensitivity is observed in children with idiopathic short stature and whether partial growth hormone insensitivity is related to growth hormone receptor defect. Twenty-five children with idiopathic short stature were studied and 30 normal children were enrolled as control. Anthropometric measurement and IGF-I generation test were performed. The growth hormone receptor gene was amplified by PCR, from leukocyte-derived DNA and sequenced directly. Despite increased IGF-I after growth hormone treatment, there was no significant correlation between delta IGF-I and delta HTSDS, as well as between delta IGFBP-3 and delta HTSDS indicating partial growth hormone insensitivity in children with idiopathic short stature. When growth hormone receptor gene were analyzed, polymorphism was observed. That is, adenine which is third base for 168th amino acid was guanine. Furthermore this finding was observed in 100% of 55 children examined, which was quite higher incidence compared to previous report from other country. The first base of 526th amino acid was either adenine or cytosine or heterozygous of adenine and cytosine, suggesting an occurrence of I526L variant. Deletions of one or two bases in flanking region of exon 3 and 8 were confirmed in Korean, the same as it occurs in Japanese. There are differences in the sequences of human growth hormone receptor gene among different ethnic populations. Wide variation of phenotype in idiopathic short stature cannot clearly be explained by growth hormone receptor gene alone. Variation or polymorphism of growth hormone receptor gene remains to be functionally analysed. In conclusion, idiopathic short stature might due to the partial growth hormone insensitivity which is resulted by mutation of growth hormone receptor gene.ope

Effect of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor(rhG-CSF) and recombinant human granul

의학과/석사[한글] 백혈병을 비롯한 악성종양 환자에서 항암화학요법후의 호중구감소증의 발생은 보다 강력한 화학요법을 하는데 있어 제한 요소로 작용한다. 집락자극인자중 granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF) 및 granulocyte macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)는 과립구계 전구세포의 증식, 분화 및 성숙을 촉진시키고, 성숙된 과립구를 골수의 저장으로부터 말초혈로 이동하도록 하는 조혈성장인자이다. 항암화학요법후 집락자극인자를 투여하면 호중구감소증에서 회복되는 기간이 단축되어 감염의 위험을 줄일 수 있다. 소아 급성 백혈병에서 항암화학요법후의 호중구감소증 환아에게 rhG-CSF 및rhGM-CSF를 투여하여 효과 유무를 알아보고 그 효과가 골수 세포충실도와 관계가 있는지 알아보고자 1993년 9월부터 1995년 3월까지 세브란스병원 소아과에 입원한 15세 미만의 급성 백혈병 환 아 중 항암화학요법후의 호중구감소증이 있었던 환아 54명을 대상으로 연구하여 다음과 같은 결과를 얻었다 1. 대상 환아는 총 54명으로 rhG-CSF 또는 rhGM-CSF투여군이 29명, 대조군이 25명이었다. 연령은 0세부터 14세였고 중앙치는 8세 였다. 성별은 남아가 38명, 여아가 16명이었다. 투여군과 비투여군 사이에 연령, 성별 및 급성 림프구성 백혈병과 비림프구성 백혈병이 차지하는 비율에는 통계학적으로 유의한 차이는 없었다. 2. 절대호중구수의 회복에 있어서 rhG-CSF 또는 rhGM-CSF투여군에서는 항암화학요법 종료후 13.8±5.0일에 절대호중구수가 500/mm**3이상으로 회복되는데 반하여 대조군에서는 16.6±5.8일이 소요되었으며 절대호중구수가 1000/mm**3 이상으로 회복되는데는 각각 14.8±5,0일, 18.4±6.5일이 소요되었고 절대호중구수가 1500/mm**3 이상으로 회복되는데는 각각 15.0±5.1일, 19.8±6.9일이 소요되어 통계학적으로 유의한 차이가 있었다. 급성 림프구성 백혈병환자 및 급성 비림프구성 백혈병환자를 각각 집락자극인자 투여군과 비투여 군으로 나누어 비교한 결과도 급성 비림프구성 백혈병환자에서 절대호중구수가 500/mm**3 이상으로 회복되는데 소요된 기간을 제외하고는 모두 의의있는 차이를 보였다. 3. 집락자극인자 투여시작시기는 항암화학요법 종료후 7.3±5.3일이었고 급성림프구성 백혈병과 급성 비림프구성 백혈병에 따른 차이나 rhG-CSF 와rhGM-CSF투여에 따른 차이는 없었다. 집락자극인자 사용기간은 9.0±6.3일이었다. 급성 림프구성 백혈병에서는 6.4±5.7일, 급성 비림프구성 백혈병에서는 11.5±5.9일로 통계학적으로 유의한 차이가 있었다. rhG-CSF와rhGM-CSF 투여에 따른 차이는 없었다. 4. 총 입원일은 rhG-CSF 또는 rhGM-CSF투여군에서는 42.6±15.8일이었고 대조군에서는 53 1±16.9일로 통계학적으로 유의한 차이를 보였다. 급성 림프구성 백혈병과 급성 비림프구성 백혈병으로 나누어 투여군과 대조군으로 비교한 결과 각각 42.0±16.8일과 48.1±8.5일, 43.1±15.4일과 59.5±22.6일로 유의한 차이를 보였다. rhG-CSF 와 rhGM-CSF투여에 따른 의의있는 차이는 없었다. 5. 집락자극인자 투여전과 투여후에 각각 골수검사를 시행하여 골수세포충실도를 관찰한 결과 투여전에는 평균 l8.5±15.1%에서 투여후에는 38.8±28.4%로 증가하였고(p<0.01) rhG-CSF군에서는 증가하였으나 의미는 없었고 rhGM-CSF에서는 통계학적으로 의미가 있었다. 대조군의 경우는 제 14일과 제 28일에 시행한 골수검사상 세포충실도가 각각 21.4±12.5%,26.4±13.8%로 통계학적으로 차이가 없었다. 6. rhGM-CSF 또는 rhGM-CSF투여의 부작용으로는 집락자극인자를 투여받은 환아 29명중 발열 3례, 오심, 흉부불편감, 사지의 이상감각이 각각 1례씩 관찰되었다 이상의 결과로 rhG-CSF 및 rhGM-CSF를 사용은 골수억제 및 호중구감소증의 회복을 도와 급성 백혈병의 치료에 보다 강한 항암화학요법을 가능하게하여 관해율을 높이고 생존율의 향상을 기대 할 수 있을 것으로 생각된다. rhG-CSF 및 rhGM-CSF 투여군에서 골수세포충실도가 집락자극인자 투여후에 대조군의 골수세포충실도에 비하여 증가한 것으로 보아 골수세포충실도와 rhG-CSF 및rhGM-CSF 투여효과 사이에는 연관이 있을 것으로 사료된다 향후 백혈병 자체의 재발여부 및 각각의 골수구성세포에 대한 계속적인 연구가 필요하리라 생각된다. [영문] An increased dosage of chemotherapy and a trial of bone marrow transplantation in acute leukemia result in severe marrow suppression. As the risk of infection associated with chemotherapy is related to the depth o fthe fall in neutrophil counts, recombinant human granulocyte colony-stimulating factor(rhG-CSF) and recombinant human granulocyte macrophage colony-stimulating factor(rhGM-CSF) have been used clinically to accelerate the recovery of normal myelopoiesis after intensive chemotherapy or bone marrow transp1antation. We conducted n randomized, controlled study to evaluate the efficacy and snfety of rhG-CSF and rhGM-CSF after intensive chemotherapy in 54 children with acute leukemia(29 cases of CSF treated group, 25 cases of control group) Patients assigned to the rhG-CSF or rhGM-CSF group received 5㎍/kg, daily, starting several day after the last day of induction chemotherauy and until the peripheral absolute neutrophil count surpassed 1000/mm**3 The observed results were as follows: 1. The time needed to reach neutrolphil recoverv of>500/mm**3, > 1000/mm**3, and of >1500mm**3 was significantly shorten in rhG-CSF or rhGM-CSF group than control group. 2. The median administration duration of rhG-CSF or rhGM-CSF was 9.0±6.3 days. 3. The hospitalization duration was shorter in rhG-CSF or rhGM-CSF group than control. 4. Bone marrow cellularity was increased from 18.5±15.1% to 38.8±28.4% after rhG-CSF or rhGM-CSF administration, but no diferenc wos observed in control group. 5. Side effect of rhg-CSF or rhGM-CSF were observed fever(10.3%),nausea(3.4%), chest discomfort(3.4%), paresthesia(3.4%), but these reactions were transient and recovered without specific treatment. In conclusuion, these results suggests that rhG-CSF or rhGM-CSF induces accelerated recovery after intensive chemotherapy in children with acute leukemia. The increase in bone marrow cellularity after rhG-CSF or rhGM-CSF administration seems to have correlation with effect of rhG-CSF or rhGM-CSF. Further long term observations are needed to evaluate the effect on leukemia relapse or rhG-CSF or rhGM-CSF.restrictio