DNA damage induces stochastic multi-site phosphorylation of TAp63α concentrated in interdomain regions reminiscent of circadian timer Period phosphorylation

Germ cells possess unusually high but transient resistance to DNA double strand breaks (DSBs) during gestational development. Upon completing meiotic recombination, oocytes during meiosis I dictyate arrest undergo a radical switch in DNA DSB sensitivity. Post-natal dictyate-stage oocytes become suddenly intolerant to very low levels of DNA DSBs induced by ionizing radiation (IR) treatment. TAp63α is a key mediator of DNA damage-induced dictyate-stage oocyte death. A surge in TAp63α expression level occurs in dictyate-stage oocytes, which coincides in timing with DNA DSB sensitivity switch of oocytes. TAp63α mediates death and elimination of DNA damaged oocytes by undergoing phosphorylation and transcriptional activation of downstream cell death-inducing genes, which helps preserve germline genome quality. Our studies indicate TAp63α phosphorylation induction itself is regulated by an auto-feedback regulatory loop involving two stages. Primary phosphorylations induce TAp63α tetramerization and transcriptional activation, which leads to subsequent secondary phosphorylations that presumably mediate cell death. In this study, I sought to distinguish primary from secondary auto-feedback phosphorylation sites using TAp63α affinity purification and mass spectrometry analysis of wild-type vs. auto-feedback TAp63α phosphorylation mutants. Our analysis indicates TAp63α phosphorylation involves greater than one hundred sites mostly clustered in inter-domain regions of TAp63α. Furthermore, primary and secondary phosphorylations appear not restricted to any specific site but appear rather stochastically induced within multi-site phosphorylation domains. The sheer number of phosphorylation sites involved suggests highly dynamic TAp63α regulation. Interestingly, TAp63α multi-site phosphorylations are strongly reminiscent of those of circadian protein, Period, suggesting TAp63α autofeedback phosphorylation functions as a phospho-timer of DNA DSB-induced oocyte death important for meiotic recombination.;이전 연구에 따르면, 발생 초기 단계의 난 모세포(oocyte)는 감수분열 재조합을 수행하기 위하여 스스로 수 백 개의 DNA 이중 가닥 절단 (DNA DSB)을 생성하지만, 이와 같은 극심한 DNA 손상에 저항성을 보인다. 반면, 재조합을 완료한 난 모세포는 곧 바로 DNA 손상에 대한 감수성이 생긴다. 따라서, dictyate 시기의 난 모세포는 전리 방사선(ionizing radiation) 치료에 의한 낮은 수준의 DNA 손상도 견디지 못하고 세포 사멸에 이른다. TAp63α는 dicytate 시기에 발현이 급증하며, 난 모세포의 DNA 손상에 의한 세포사멸 기전의 주요 중재자로 알려져 있다. 즉, DNA가 손상되면 전사인자인 TAp63α가 인산화가 되고 결론적으로 세포사멸 유전자의 전사활성화를 유도하여 손상된 난 모세포를 제거시킨다. 반면, 아직까지 인산화에 의한 TAp63α의 메커니즘(들)은 불분명하다. 특히, 전사 활성화를 매개하는 인산화 잔기는 알려지지 않은 상태이다. 우리의 초기 연구는 TAp63α 인산화가 auto-feedback regulatory loop에 의해 자가 조절된다는 가설을 제시한다. 또한, 인산화는 두 단계로 이루어지며, 전사활성에 필요한 tetramerization의 위한 1차 인산화 그리고 전사활성 이후에는 TAp63α의 분해 및 세포사멸과 관련된 2차 인산화로 구성된다고 주장한다. 이 연구에서는 TAp63α의 auto-feedback regulatory loop 가설을 증명하고자 TAp63α의 정제 및 질량분석기법 (LC-MS/MS)을 통해 1차 및 2차 인산화 잔기를 규명하고자 했다. 결과적으로 TAp63α 인산화는 주로 도메인 사이 지역에 집중되며 1차 및 2차 인산화는 특정 잔기에 국한되어 있기보다는 인산화 밀집부위 내에서 확률적으로 일어나는 것으로 확인되었다. TAp63α 활성화에 관여하는 인산화 잔기의 수 및 조합을 감안할 때, 인산화 조절이 매우 역동적으로 일어난다는 것으로 판단된다. 흥미롭게도 TAp63α의 다중 인산화 (muti-site phosphorylation) 패턴은 circadian rhythm과 관련 전사 단백질, Period에도 보존이 된다는 점을 발견할 수 있었으며, 이는 TAp63α의 인산화도 타이밍 메커니즘을 지닐 가능성을 시사한다.I. Introduction 1 II. Materials and Methods 12 1. Cell culture 12 2. p63 DNA Constructs 12 3. Gene transfection 13 4. Tandem Affinity Purification for LC-MS/MS 14 5. Sample Preparation for LC-MS/MS 15 6. SDS PAGE and Western Blotting 15 8. Immunofluorescence 16 9. LC-MS/MS analysis for phosphorylated TAp63α (KIST) 16 10. LC-MS/MS analysis for phosphorylated TAp63α (Proteome Tech) 18 III. Results 20 1. Overexpression of TAp63α leads to auto-phosphorylation 20 2. Primary and secondary phosphorylation sites occur rather stochastically rather than site-specifically 26 3. High level phosphorylations observed in irradiated WT TAp63α point to potential candidates of auto-feedback phosphorylation sites 33 4. Assessing a new model for C-terminal phosphorylation 38 5. Phosphorylation increases in the SAM-TID interphase in the presence of DNA damage 46 6. Putative CK1 sites are critical for DNA damage-induced phosphorylation 52 7. Inhibition of CA-sensitive Ser/Thr phosphatases leads to hyperphosphorylation of TAp63α 57 8. CA-induced hyper-phosphorylation does not necessarily lead to a complete saturation of all possible S/T/Y sites 60 9. The protein phosphatases 2A B binding motif in the TA domain suggests potential interaction with phosphatase 67 10. Mutant constructs of TAp63α differ in response towards phosphatase inhibition 70 11. Defects in the sterile alpha motif (SAM) domain disrupt the irradiation-induced phosphorylation shift of TAp63α 72 IV. Discussion 77 V. References 82 국문초록 8

Impact of the perceived characteristics of complementary products on the patronage of main products

The market of complementary products (third-party products) has been rapidly increasing. Complementary products increase the utility of main products by providing more users and this can enhance the value of main products and affect consumers’ purchase in the end. The goal of this study is to explore how the characteristics of complementary products influence the patronage of main products. Perceived value and switching cost of main products are used as the mediating variables. Survey methodology was used to test the hypotheses and iPod MP3 was given as the main product because it has various complementary products and many users. A total of 248 questionnaires were analysed and the main findings are as follows: First, the characteristics of complementary products, variety, compatibility and price, proved to increase the perceived value of main products. Second, perceived variety and price of the complementary products positively affected the perceived switching cost of the main product. However, perceived compatibility of the complementary products decreased perceived switching cost of the main product. Third, contrary to the hypotheses, perceived value of the main product did not significantly increase perceived switching cost of the main products. Fourth, perceived value and switching cost of the main product positively affected main product patronage. This study attempted to extend existing research of complementary products. It showed how the characteristics of complementary products affect main product patronage through such mediating variables as perceived value and switching cost of the main product. In terms of marketing practices, this study suggests that third-party products become significant means for customer retention and sales increase because they can increase the value and switching cost of the main product. Therefore, investment for the development of complementary products becomes an important strategic decision making in product development and increasing product patronage.;최근 써드 파티 제품(third-party products)이라 불리는 보완제품 시장이 하나의 산업 및 경제로 자리 잡고 있는 가운데, 그 영향력은 단순한 관련제품의 정도를 넘어 주제품의 가치를 증대시키는 것에 이르고 있다. 기존의 연구에서는 제품의 사용자가 증가함에 따라, 해당 제품과 호환이 되는 보완제품들의 공급이 늘어나게 되어 해당 제품으로부터 얻는 효용이 증가하는 간접적인 네트워크 효과가 존재한다고 밝히고 있다. 이는 보완제품이 주제품의 가치를 높이는 역할을 하며, 결국 소비자의 구매에도 영향을 미친다는 것을 의미한다. 그러므로 소비자의 측면에서 보완제품이 구매에 미치는 영향을 실증적으로 연구하는 것이 필요하다. 이에 본 연구에서는 네트워크 효과 및 보완제품, 지각된 가치, 전환비용, 지속적 사용가능성의 개념 및 이론에 관한 문헌 연구를 통하여 지각된 보완제품의 특성이 지각된 주제품의 가치와 전환비용을 매개로 주제품의 지속적 사용가능성에 미치는 영향을 알아보고자 하였다. 본 연구를 위해 문헌 연구를 토대로 가설을 도출하였고, 가설검증을 위하여 설문지를 통해 자료를 수집하였다. 연구대상은 다양한 보완제품을 갖고 있으며 사용자가 많은 iPod MP3로 선정하였으며, 실제 소비자가 지각하는 가치와 전환비용에 대해 측정하기 위해 iPod MP3 사용자로 조사대상을 한정하였다. 회수된 설문지 중 248부를 분석에 사용하였고, 통계적 분석은 SPSS 12.0과 AMOS 5.0을 사용하였다. 본 연구의 결과를 요약하면 다음과 같다. 첫째, 지각된 보완제품의 세 가지 특성(다양성, 호환성, 가격)은 주제품의 지각된 가치에 유의한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이는 (a)사용자가 보유하고 있는 보완제품의 종류가 다양하고 수가 많다고 인지할수록, (b)사용자가 보유하고 있는 보완제품이 후속제품, 다른 브랜드의 제품 그리고 다른 종류의 휴대기기와 함께 사용할 수 있는 정도가 높다고 인지할수록, (c)사용자가 보유하고 있는 보완제품의 가격을 높게 지각할수록, 주제품의 가치를 높게 인지함을 의미한다. 둘째, 지각된 보완제품의 세 가지 특성(다양성, 호환성, 가격)은 주제품의 지각된 전환비용에 유의한 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이는 (a)사용자가 보유하고 있는 보완제품의 종류가 다양하고 수가 많다고 인지할수록, (b)사용자가 보유하고 있는 보완제품이 후속제품, 다른 브랜드의 제품 그리고 다른 종류의 휴대기기와 함께 사용할 수 있는 정도가 낮다고 인지할수록, (c)사용자가 보유하고 있는 보완제품의 가격을 높게 인지할수록, 주제품을 교체할 때 인지하는 전환비용이 높아짐을 의미한다. 셋째, 보완제품과 함께 인지되는 주제품의 가치는 주제품을 교체할 때 사용자가 인지하는 전환비용에 유의한 영향을 미치지 못하는 것으로 나타났다. 넷째, 주제품의 지각된 가치와 전환비용은 주제품의 지속적 사용가능성에 정(+)의 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이는 (a)사용자가 지각하는 주제품의 가치가 높을수록, (b)주제품을 교체할 때 인지하는 전환비용 즉 심리적, 경제적 부담이 높을수록, 향후 해당 제품 또는 해당 브랜드의 후속제품을 사용할 가능성이 높아짐을 의미한다. 이상의 결과는 다음과 같은 학문적, 실무적 의의를 가지고 있다. 첫째, 기존 연구에서 다뤄지던 주제품의 특성 및 가치, 전환비용 그리고 재구매의도의 모형을 확장시켜, 보완제품의 특성이 주제품의 지각된 가치와 전환비용을 매개로 주제품의 지속적 사용가능성에 미치는 영향에 대해 포괄적인 모형을 제시하고, 소비자 측면에서 실증적으로 규명했다. 둘째, 지각된 보완제품의 특성이 주제품의 지각된 전환비용을 매개로 주제품의 지속적 사용가능성에 유의한 영향을 미침을 검증함으로써, 주제품의 전환비용으로써 보완제품의 역할을 규명하였다. 또 기존에 많이 다뤄지지 않은 소비자측면에서의 보완제품 연구를 통해 전환비용과 연결고리를 설명하였다. 이를 통해 최근 하나의 산업 및 시장으로 자리잡고 있는 써드 파티 제품(third party products)이 주제품을 생산하고 판매하는 기업에게 주제품의 고객유지를 위한 하나의 수단이 될 수 있음을 제시하였다. 그러므로 보완제품을 별개의 제품으로 인식하는 것이 아니라 주제품의 가치를 형성하는 하나의 네트워크로 보고 전략적으로 관리 하는 것이 중요하다. 이는 주제품의 가치와 전환비용를 높여 고객의 지속적 사용가능성을 높여줄 것이며, 기존 고객의 유지가 기업성공의 중요한 요인이라는 점에서 제품 및 후속제품의 사용을 지속시킬 수 있는 보완제품의 특성을 규명하는 것은 기업의 마케팅전략 수립에 시사점을 제공할 것이다. 셋째, 주제품과 보완제품의 네트워크 상황에서 주제품의 지속적 사용가능성에 영향을 미치는 보완제품의 특성을 제시하여, 이후 소비자 측면에서의 보완제품 연구에 기초를 제공하였다. 이는 보완제품을 생산하고 판매하는 기업에게 있어 제품 개발시 고려해야 하는 시사점을 제공할 것이다. 주제품의 지속적 사용가능성에 영향을 미치는 보완제품의 지각된 특성은 향후 제품 개발에 기초를 제공하고, 소비자의 지각을 반영한 필수적인 고려 요소로서의 역할을 할 수 있을 것이다. 또한 보완제품 시장에 진출하려는 기업에게도 전략적 시사점을 제공할 수 있을 것이다.Ⅰ. 서론 = 1 A. 문제제기 및 연구목적 = 1 B. 연구방법 = 4 C. 논문의 구성 = 5 Ⅱ. 이론적 고찰 = 6 A. 네트워크 외부성과 보완제품에 관한 이론적 고찰 = 6 B. 지각된 가치에 관한 이론적 고찰 = 9 C. 전환비용에 관한 이론적 고찰 = 12 D. 지속적 사용가능성에 관한 이론적 고찰 = 15 Ⅲ. 연구가설 설정 및 연구모형 = 16 A. 연구가설 설정 = 16 1. 보완제품의 지각된 특성이 주제품의 지각된 가치에 미치는 영향 = 16 2. 보완제품의 지각된 특성이 주제품의 지각된 전환비용에 미치는 영향 = 17 3. 주제품의 지각된 가치가 주제품의 지각된 전환비용에 미치는 영향 = 19 4. 주제품의 지각된 가치와 전환비용이 지속적 사용가능성에 미치는 영향 = 20 B. 연구모형 = 22 Ⅳ. 연구조사방법 = 23 A. 변수의 조작적 정의 = 23 B. 측정방법 = 25 C. 표본선정 및 자료수집 = 27 D. 분석방법 = 28 Ⅴ. 연구결과 및 해석 = 29 A. 연구대상 및 특성 = 29 B. 신뢰성 및 타당성 검증 = 31 C. 연구가설의 검증 = 36 Ⅵ. 결론 및 제언 = 42 A. 연구 결과의 요약 = 42 B. 연구의 의의 = 44 C. 연구의 한계점 및 향후 연구 방향 = 46 참고문헌 = 48 부록. 설문지 = 54 Abstract = 5