다형성 교모세포종에서 아데노바이러스 매개 antisense-VEGF를 이용한 유전자요법

암은 치료의 발전에도 불구하고 이로 인한 사망율은 감소되고 있지 않아 새로운 개념의 항암치료의 개발이 필요하다. 발암 유전자(oncogene)나 종양억제 유전자(tumor suppressor gene)를 조작하는 방식의 유전자요법으로 항암 효과를 얻기 위해서는 대상 암종의 모든 세포의 유전적 변환을 유도해야 하는데 이 문제점을 극복하기 위해 종양의 성장에 필요한 신생혈관형성의 조절을 표적으로 한 치료가 종양치료의 한 방법으로 기여 할 수 있을 것으로 생각된다. 고형 종양의 지속적인 성장을 위해서는 신생혈관형성이 필수적이며 신생혈관의 형성정도는 전이빈도 및 환자의 예후와 관계가 있다. 종양 세포는 basic fibroblast growth factor(bFGF), vascular endothelial growth factor(VEGF)등의 신생혈관형성 촉진인자와 신생혈관형성 억제인자를 생성하여 이 과정에 참여한다. 여러 가지 신생혈관형성 촉진인자 중 신생혈관형성 및 종양의 성장에 VEGF가 가장 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 본 연구에서는 VEGF 과발현된 다형성 교모세포종에서 antisense -VEGF를 이용한 치료 모델을 고안하기로 하였다. Antisense-VEGF를 종양 내로 이입시키기 위해서는 적절한 운반 방법이 필요한데 유전자요법에 널리 이용되고 뇌조직을 포함한 여러 조직에 친화성이 있는 아데노바이러스를 매개로 한 방법으로 하였다. 다형성 교모세포종 세포주에서VEGF165에 대한 유전자를 antisense방향으로 가진 아데노바이러스 벡터(Ad5CMV- VEGF)를 이용한 신생혈관형성 억제치료를 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 다형성 교모세포종 세포주인 U-87 MG에서 아데노바이러스를 매개로 한 유전자 전달은 Ad5CMV- gal을 이용한 -gal assay상 20 MOI에서의 transduction efficiency는 75 ± 2.4 %였으며 MOI를 증가시킬수록 transduction efficiency가 증가하여 100 MOI 에서는 97 ± 1.5 %였다 2. Ad5CMV- VEGF를 처리한 U-87 MG세포에서의 내인성 VEGF mRNA의 down-regulation은 아데노바이러스 감염 후 3일에서 5일사이에 가장 현저하였으며 MOI를 증가시킴에 따라 VEGF mRNA 감소정도가 증가했다. 외인성 0.8 kb antisense VEGF mRNA는 Ad5CMV- VEGF로 감염시킨 세포에서만 검출되었으며 이는 Ad5CMV- VEGF가 세포내로 성공적으로 transduction되었음을 의미한다. 3. Ad5CMV- VEGF나 Ad5(dl312)로 처리한 세포주에서 secretory VEGF 단백질양의 측정을 위해 세포 배양액을 이용하여 ELISA를 시행하였다. Mock-감염 세포와 Ad5(dl312) 100 MOI로 처리한 세포를 배양하던 배양액내의 VEGF농도는 감염 6일 후 1451.7 ± 178.5 pg/ml/105 cells/24hr, 1468 ± 328.5 pg/ml/105 cells/24hr인데 반해 Ad5CMV- VEGF 100 MOI를 처리한 세포의 경우 888.7 ± 153.8 pg/ml/105 cells/24hr으로 상대적으로 감소되어 있었으며 Ad5CMV- VEGF 감염 후 9일에 secretory VEGF 단백질은 654.5 ± 18.2 pg/ml/105 cells/24hr으로 감소되었다. 그러나 세포 추출액에서 bFGF ELISA를 시행한 결과 bFGF의 발현은 억제되지 않았다. 4. Ad5CMV- VEGF로 감염시킨 U-87 MG 세포의 세포 배양액에서의 성장은 mock-감염세포나 Ad5(dl312)로 감염시킨 세포에 비해 감소되지 않았으며 각각의 population doubling level은 mock-감염세포, Ad5(dl312), Ad5CMV- VEGF로 감염시킨 세포에서 각 각 2.55, 2.62, 2.42로 차이가 없었다. 5. Nude mice에 U-87 MG 피하 종양을 만든 후 4일에 혈청을 함유하지 않은 배양액, 109 pfu의 Ad5CMV- VEGF나 Ad5(dl312)를 2일 간격으로 4회 종양내치료하였다. 4주후 종양의 크기는 혈청을 함유하지 않은 세포 배양액만으로 치료한 경우 977.2 ± 83.05 mm3, Ad5(dl312)로 치료한 경우 1475.6 ± 255.50 mm3인데 반해 Ad5CMV- VEGF로 치료한 군의 경우 236.3 ± 78.89 mm3로 의미 있게 대조군에 비해 낮았다(p=0.001). 6. 적출한 U-87 MG 피하 종양에서의 anti-VEGF 와 CD34 단클론 항체를 이용한 면역조직화학염색 검사상 Ad5CMV- VEGF치료군에서 Ad5(dl312)대조군에서보다 VEGF 발현이 감소되었고 미세혈관 수가 감소되어 있었다(p=0.01). 이상의 결과로 아데노바이러스를 매개로 한 antisense-VEGF 치료로 다형성 교모세포종 세포주인 U-87 MG에서 혈관 내피세포 성장인자의 mRNA 및 단백질의 생성을 감소시킬 수 있고 생체에서 종양의 성장 속도 감소 효과가 있어 신생혈관 형성의 조절을 표적으로 한 유전자요법이 종양 치료의 한 방법으로 기여 할 수 있을 가능성이 있다고 생각된다. ; New strategies are needed for the treatment of cancer. Among targets suitable for new therapies are regulator of angiogenesis. Angiogenesis modulators are important in tumor growth, as shown by the fact that neovascularization must occur for solid tumors to grow beyond a diameter of 2 to 3 mm. Glioblastoma multiforme is one of the most highly vascularized human cancers and vascular endothelial growth factor(VEGF) is a major positive effector of angiogenesis in this tumor. Inhibition of the endogenous VEGF expression by antisense VEGF sequence resulted in reduced vasculature and decreased tumor growth. The author has constructed a replication-deficient adenoviral vector containing the VEGF cDNA in an antisense orientation(Ad5CMV-αVEGF) to down-regulate VEGF expression and increase the in vivo applicability of antisense sequence. The effect of Ad5CMV-αVEGF on cell growth and VEGF expression was studied in vitro with human glioma cell line U-87 MG and tested in vivo efficacy with established subcutaneous U-87 MG tumors in nude mice. The results were as follows 1. According to -gal assay using Ad5CMV- gal, the transduction efficiency of human malignant glioma cell line U-87 MG was 75.2 % at 20 MOI, and the transduction efficiency increased with higher MOI and reached to 97% at 100 MOI. 2. VEGF expression increased with progressive growth of cells, but after Ad5CMV-αVEGF treatment at MOIs 25-400, endogenous VEGF mRNA expression was down-regulated and secretory VEGF protein was decreased upto 30-55% compared with Ad5(dl312)-treated control group. 3. Down-regulation of the other angiogenic factor, bFGF, was not observed after treated with Ad5CMV- VEGF, confirming that the Ad5CMV- VEGF effect is specific to VEGF. 4. The growth curve of U-87 MG cells treated with Ad5CMV- VEGF remained as same as that of mock-infected and Ad5(dl312)-infected U-87 MG cells, suggesting that Ad5CMV- VEGF does not have direct cytotoxic effect. 5. The growth of subcutaneous human glioma tumors established in nude mice was inhibited by early intratumoral injection of Ad5CMV- VEGF. 6. Immunohistochemical staining of subcutaneous tumors using anti-VEGF Ab and CD34 showed that VEGF secretion and mean microvessel counts were decreased in Ad5CMV- VEGF treatment group. In conclusion, the growth of subcutaneous human glioma tumors established in nude mice was inhibited by intratumoral injection of Ad5CMV- VEGF, demonstrated that efficient down-regulation of VEGF expression in glioma has an antitumor effect in vivo and Ad5CMV- VEGF is a feasible tool for antiangiogenic therapy in vivo.논문개요 ------------------------------------------------------------ ⅸ I. 서론 ------------------------------------------------------------- 1 II. 연구재료 및 방법 ------------------------------------------------ 5 A. 아데노바이러스 벡터의 합성 -------------------------------------- 5 B. 아데노바이러스 감염방법 ----------------------------------------- 8 C. 세포주와 세포의 배양 -------------------------------------------- 8 D. Transduction efficiency의 결정 ---------------------------------- 8 E. RNA분리 및 Northern blot검사 ------------------------------------ 9 F. VEGF 효소결합면역흡착검사 --------------------------------------- 10 G. bFGF 효소결합면역흡착검사 --------------------------------------- 11 H. In vitro 세포 성장 곡선 ----------------------------------------- 12 I. In vivo에서의 Ad5CMV- VEGF 치료 --------------------------------- 12 J. 면역조직화학염색 ------------------------------------------------ 13 K. VEGF 발현도 및 미세혈관 수의 측정 ------------------------------- 14 L. 통계 분석 ------------------------------------------------------- 14 III. 연구 결과 ------------------------------------------------------ 16 A. 다형성 교모세포종 세포주인 U-87 MG에서 아데노바이러스를 매개로 한 유전자 전달 ----------------------------------------------------- 16 B. Ad5CMV- VEGF를 처리한 U-87 MG세포에서의 내인성 VEGF mRNA의 발현 정도 ------------------------------------ 16 C. Ad5CMV- VEGF를 처리한 U-87 MG세포에서의 내인성 VEGF 단백질 및 bFGF 단백질의 발현 정도 ----------------------------------------- 20 D. Ad5CMV- VEGF로 감염시킨 U-87 MG 세포의 in vitro 성장 ------------ 20 E. Ad5CMV- VEGF치료에 의한 in vivo에서 종양의 성장 변화 ------------ 24 F. Ad5CMV- VEGF치료에 의한 피하 종양에서의 VEGF 발현도 및 미세혈관 수의 변화 ---------------------------------------------- 24 IV. 고찰 ------------------------------------------------------------ 28 V. 결론 ------------------------------------------------------------- 36 참고문헌 ------------------------------------------------------------ 38 영문초록 ------------------------------------------------------------ 4

A multi-center, latephase II clinical trial of Genexol® (paclitaxel) and cisplatin for patients with advanced gastric cancer

Because of unsatisfactory treatment results with 5-fluorouracil-based palliative combination chemotherapy for advanced gastric cancer, the evaluation of new effective and well-tolerated regimens is needed. We conducted a multi-center, late phase II trial to evaluate the efficacy and safety of Genexol® (a paclitaxel formulation) combined chemotherapy with cisplatin in patients with previously untreated metastatic or unresectable measurable gastric adenocarcinoma. All patients were between 18 and 75 years of age, with an Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG) performance status of 0 to 1, and had an adequate baseline major organ function. Genexol 175 mg/m2 was administered as a 3-h infusion, followed by cisplatin 75 mg/m2 as an intravenous infusion day 1, once every 3 weeks. Thirty-six patients were enrolled from 7 hospitals between November 2002 and April 2003. Of these, 33 patients were assessable for efficacy and 35 for toxicity. Based on an intent-to-treat analysis, 16 patients (46%) achieved a partial response, 7 (20%) stable disease, and 10 (29%) progressed, giving an overall response rate of 46% (95% CI, 29% to 63%). The median duration of response was 7.1 months (95% CI, 6.3 to 7.9 months), and the median time to progression and overall survival were 4.9 months (95% CI, 3.2 to 6.6 months) and 13.8 months (95% CI, 10.8 to 16.8 months), respectively. The major toxicity was neutropenia, with grade 3/4 intensity in 10 patients (29%). However, no febrile neutropenia occurred, and non-hematologic toxicity was usually mild. Grade 3/4 toxicities included nausea (9% of the patients), vomiting (9%), peripheral neuropathy (9%), alopecia (9%), and myalgia (6%). In conclusion, the combination of Genexol and cisplatin was found to be an active and relatively well-tolerated regimen for the treatment of advanced gastric carcinoma

직장출혈력이 없는 빈혈 환자에서의 대장내시경의 역할

목적: 빈혈의 원인을 찾기 위해 상부위장관내시경은 널리 시행되어 왔지만, 대장내시경의 유용성 및 역할에 대한 정보는 부족하다. 본 연구에서 저자들은 직장출혈력이 없는 빈혈환자에서 대장내시경 검사를 통한 빈혈의 원인을 분석하여 그 유용성을 확인해 보고자 하였다. 대상 및 방법: 본 연구는 2001년 1월부터 2002년 12월까지 빈혈의 원인을 찾기 위해 대장내시경을 시행한 147명의 환자들의 기록을 후향적으로 살펴보았다. 결과: 환자들의 평균 연령은 48±17세(범위 15～90)이었으며, 남녀비가 1：4.3이었다. 94명(63.9%)이 철결핍성빈혈에 합당하였으며, 21.8% 환자에서 혈색소치가 7.0 g/dL 이하였다. 대장내시경에서 빈혈과 연관되어 보이는 이상소견은 76명(94예)에서 나타났으며, 치핵(35예), 용종(31예), 결핵(9예), 대장암(8예), 게실(8예), 자궁내막증(1예), 혈관 이형성증(1예), 궤양성 대장염(1예)의 순으로 나타났다. 대장내시경의 병변은 고령군에서(≧55세, p=0.034) 더 빈도가 높았으나 자궁내막증, 궤양성 대장염 및 장결핵은 모두 젊은 연령군(＜55세)에서 관찰되었으며, 8명의 대장암 환자 중 2명은 39세와 49세로 젊은 남자에서 확인되었다. 결론: 빈혈의 원인으로 추정할 수 있는 대장의 병변이 고령군에서 높게 나타났으나, 젊은 연령군에서도 빈도가 높은 질환이 있었으며 치명적인 질환도 관찰되어, 대장내시경은 빈혈이 있는 젊은 연령군과 고령군 모두에서 진단적인 가치가 있는 검사로 생각한다. Background/Aims: For evaluation of anemia, esophagogastroduodenoscopy (EGD) is widely used. However, there is no sufficient information on the efficiency and role of colonoscopic evaluation for these anemia patients. We aimed to evaluate the diagnostic yield of colonoscopy in anemia patients with nonactive rectal bleeding. Methods: This was a retrospective study from January 2001 to December 2002. We reviewed 147 patients who underwent colonoscopy for anemia evaluation. Results: The mean age was 48 17 years (range 15∼90), and male to female ratio was 1：4.3. Ninety-four patients (63.9%) had iron deficiency anemia and 21.8% of them have less than 7 g/dL of hemoglobin. Abnormal colonoscopic findings were observed in 84 patients (57.1%) including hemorrhoid (35), polyp (31), tuberculosis (9), cancer (8), diverticulum (8), endometriosis (1), angiodysplasia (1), and ulcerative colitis (1). The presence of abnormal colonoscopic findings was more frequently observed in older population (≥55 years old, p=0.034). Intestinal tuberculosis, endometriosis, and ulcerative colitis were observed only in younger population (＜55 years old), and 2 of 8 cancer patients were 39 and 49 years old males. Conclusions: Although the diagnostic yield of colonoscopy is relatively higher in older population, colonoscopy is one of the valuable tools in anemia evaluation of both older and younger populations

Implications of Tamoxifen Resistance in Palbociclib Efficacy for Patients with Hormone Receptor-Positive, HER2-Negative Metastatic Breast Cancer: Subgroup Analyses of KCSG-BR15-10 (YoungPEARL)

Purpose YoungPEARL (KCSG-BR15-10) trial demonstrated a significant progression-free survival (PFS) benefit for premenopausal patients with hormone receptor-positive/human epidermal growth factor receptor 2-negative (HR+/HER2-) metastatic breast cancer (MBC) for palbociclib plus exemestane with ovarian function suppression compared to capecitabine. However, the number of tamoxifen-sensitive premenopausal patients was small because most recurrences occurred early during adjuvant endocrine therapy (ET), with tamoxifen being the only drug used; hence, the data for these patients were limited. Here we present a subgroup analysis according to tamoxifen sensitivity from the YoungPEARL study. Materials and Methods Patients were randomized 1:1 to receive palbociclib+ET (oral exemestane 25 mg/day for 28 days, palbociclib 125 mg/day for 21 days, plus leuprolide 3.75 mg subcutaneously every 4 weeks) or chemotherapy (oral capecitabine 1,250 mg/m(2) twice daily for 14 days every 3 weeks). Tamoxifen resistance was defined as: relapse while on adjuvant tamoxifen, relapse within 12 months of completing adjuvant tamoxifen, or progression while on first-line tamoxifen within 6 months for MBC. Results In total, 184 patients were randomized and 178 were included in the modified intention-to-treat population. PFS improvement in the palbociclib+ET group was observed in tamoxifen-sensitive patients (hazard ratio, 0.38; 95% confidence interval, 0.12 to 1.19). Furthermore, palbociclib+ET prolonged median PFS compared with capecitabine in tamoxifen-sensitive (20.5 months vs. 12.6 months) and tamoxifen-resistant (20.1 months vs. 14.5 months) patients. Palbociclib+ET demonstrated a higher rate of objective response, disease control, and clinical benefit in tamoxifen-sensitive patients. Conclusion This post hoc exploratory analysis suggests that palbociclib+ET is a promising therapeutic option for premenopausal HR+/HER2- MBC patients irrespective of tamoxifen sensitivity

적혈구, 혈소판 및 신선동결혈장 수혈의 적정성 평가

배경 : 저자들은 적혈구, 혈소판, 신선동결혈장 수혈의 적응증에 대한 대한수혈학회수혈지침과 문헌검토후 기존의 원내수혈지적혈구, 혈소판 및 신선동결혈장 수혈의 적정성 평가 453침을 개정 및 보완하였고. 이를 바탕으로 작성된 수혈적정성 평가표를 가지고, 본원의 적혈구, 혈소판 및 신선동결혈장 수혈의적정성을 평가하였다.방법 : 2002년에 이대목동병원에서 시행된 26예(적혈구수혈14예, 혈소판수혈 61예, 신선동결혈장 수혈 61예)의 수혈에 대해 의무기록의 후향적 조사의 방법으로 평가하였다. 결과 :적혈구, 혈소판 및 신선동결혈장의 부적정사용률은 각각2.8%, 4.9% 및 44.3%이었다. 적혈구수혈 14예는 급성실혈에서의 수혈 73예와 만성빈혈에서의 수혈 71예로 구성되었는데, 각각2예씩이 부적정사용이었다. 혈소판수혈 61예는 골수부전에서의수혈 32예와 활동성 출혈에서의 13예, 급성파종성응고증에서의 6예 등의 적응증으로 구성되었다. 이중 임상적 출혈로 사용된 3예가 부적정으로 평가되었다. 신선동결혈장수혈 61예 중 34예가 적정 사용되었는데 중증 간질환에 합병증이 동반된 경우 16예, 급성 파종성혈관내 응고증 1예 및 기타 7예이었고. 27예가 부정적사용되었는데 중증 간질환에 합병증 없이 PT만 연장된 8예, 수술관련 10예, 기타 9예이었다

젊은 여성의 유방에 발생한 원발성 활막 육종 1예

활막 육종은 주로 관절 주위 조직에 호발하는 악성 종양이다. 종종 관절 이외의 다른 부위에 발생하는 경우도 보고되어있는데, 원발성 유방 활막 육종은 세계적으로도 보고된 예가 드물다. 본 증례는 원발성 유방 활막 육종으로 진단된 15세 여자 환자의 1예이다. 진단 후 유방 종괴에 대한 광범위 절제술을 시행하였으나 9개월 후 국소 재발하였고, 이에 재발 부위에 대한 광범위 절제술을 다시 시행하였다. 그러나, 27개월 후 폐의 우상엽에 고립성 폐 전이가 발견되었다. 이에 폐 병변에 대한 절제술 및 고식적 화학요법으로 doxorubicin 및 ifosfamide의 병합 화학요법을 시행하였다. 현재 항암화학요법 종료 후 28개월째 재발의 증거 없이 경과관찰 중이다. 이에 저자들은 본 증례를 문헌고찰과 함께 보고하는 바이다

성인 고형암 환자의 고칼슘혈증 치료현황과 치료효과 분석

Background: Hypercalcemia is an important metabolic emergency condition in cancer patients. Bisphosphonate is the treatment of choice for hypercalcemia, whereas calcitonin and hydration with furosemide are recommended for acute supportive therapy