MV4-11 (FMS-like tyrosine kinase (FLT)3-internal tandem duplication (ITD) 변이 및 BCL2 과발현) 세포주에서 midostaruin과 ABT199에 의한 표적 항암치료

학위논문 (석사)-- 서울대학교 대학원 : 약학대학 약학과, 2019. 2. Diederich, Marc.급성 골수성 백혈병 (Acute myeloid leukemia, AML)은 골수성 혈액 암으로서, 유전학적, 생리학적 이상으로 발병되는 것으로 보고되어 있다. 특히, FMS-like tyrosine kinase 3 (FLT3)는 세포 생존, 증식 및 분화에 핵심적인 역할을 하는 수용체로, 특히 재발환자에서 나타나는 FLT3-ITD 돌연변이는 그 예후를 악화한다. 본 연구에서는 단백질의 기초 발현 수준을 다양한 AML 세포주에서 확인하고 FLT3 인산화 및 Bcl-2 관련 단백질의 과발현 특성을 가진 MV4-11 세포주를 선택하였다. 보다 효율적인 표적 화학 요법을 제안하기 위해 FLT3-ITD와 BCL-2를 선택적으로 억제하는 midostaurin (Rydapt)과 ABT199 (Venetoclax)의 sub-toxic한 농도를 산출하였다. 두 화합물의 Sub-toxic한 농도는 각각 MV4-11 세포주에서 생존능력에 큰 영향을 미치지 않은 것과 대조적으로, 동반처리 후 caspase의존성 세포사멸기전을 유도함으로써 유의미한 상승효과를 확인하였다. 뿐만 아니라, 이 조합은 정상 세포주에서 유의미한 세포독성을 나타내지 않았다. 이 결과를 바탕으로 통계적으로 Chou-Talalay 의 CompuSyn 소프트웨어를 이용하여 combination index를 산출하였다. 또한, 두 조합에 의한 세포독성을 annexin V/PI 염색을 통해 flow cytometry로 정량 하였고, 전체 caspase 를 억제하는 z-VAD-FMK 처리를 통해 Caspase 의존성 세포사멸 기전을 검증하였다.Acute myeloid leukemia (AML) is a heterogenous disease with low survival rate, and relapsed AML with FMS-like tyrosine kinase (FLT)3 (FLT3)-internal tandem duplication (ITD) mutations worsens the prognosis of the patients. After an initial profiling of AML cell lines, we selected the cell line MV4-11 presenting both the FLT3-ITD mutation as well as overexpression of the antiapoptotic BCL2 resistance protein. In an attempt to suggest a more efficient targeted chemotherapeutic approach, we determined sub-toxic doses of midostaurin targeting the FLT3-ITD and ABT199 (Venetoclax), a specific inhibitor of BCL2. Whereas subtoxic doses of both compounds did not strongly affect viability of MV4-11 cells, a combination treatment synergistically triggered caspase-dependent apoptotic cell death compared to AML cells lines without FLT3 mutation or cells with a healthy phenotype. Our results could be validated by calculation of the combination index according to Chou-Talalay. Moreover, the cytotoxic effect of the combination treatment was evaluated by Annexin-PI staining and flow cytometry and detection of caspase activation with or without pre-treatment of the pan-caspase inhibitor z-VAD-FMK. Importantly, the combination of midostaurin and ABT199 reduced the tumor formation in in vitro colony formation assays and zebrafish xenografts. Altogether, we suggest a novel, more efficient chemotherapeutic approach for AML patients expressing both elevated levels of antiapoptotic BCL2 and mutated FLT3.Table of Contents 1. INTRODUCTION 1 2. MATERIAL AND METHODS 4 2.1 Compounds 4 2.2 Cell culture and treatments 4 2.3 Cell Proliferation and viability 5 2.4 Protein extraction and western blots 5 2.5 Quantification of apoptosis 5 2.6 Colony formation assay 6 2.7 Investigation of cellular morphology 6 2.8 Zebrafish xenografts 7 2.9 Statistical analysis 8 3. RESULTS 9 3.1 Effect of midostaurin on the viability of AML cell lines with differential phosphorylation levels of FLT3 and BCL2 protein patterns 9 3.2 Midostaurin and ABT199 induce caspase-dependent apoptosis 18 3.3 Synergistic apoptotic effect of a combination of midostaurin and ABT199 21 3.4 Validation of synergistic combination treatments by colony formation assays and in vivo zebrafish xenografts 28 4. DISCUSSION 31 5. REFERENCES 37 6. 국문초록 40Maste

Evidence of a stepwise reaction mechanism for reactions of dibenzo[1,2]oxathiin 6-oxide with alicyclic secondary amines and sodium ethoxide

본 연구는 25℃, 수용액에서 dibenzo[1,2]oxathiin 6-oxide와 일련의 2차 아민의 친핵성 치환반응 속도를 분광학적으로 연구한 것이다. 일반적으로 aminolysis 반응에서 유사일차 반응속도와 아민의 농도를 상관 지은 그래프는 general acid/base catalysis의 유무에 의해서 위로 휘어지는 곡선이나 직선을 나타낸다. 그러나 본 반응계에서 유사일차 반응속도와 아민의 농도를 상관지은 그래프는 아래로 휘어지는 곡선을 보였다. 이와 같이 아래로 휘어지는 곡선은 aminolysis 반응에서는 처음으로 관측된 것이다. 또한, 이것은 하나 이상의 중간체를 경유하는 첨가-제거 메카니즘으로 반응이 진행함을 제시해주는 증거이다. Aminolysis 반응에서 속도결정단계(rds) 변화(pK_0)는 4～5 + pK_a(lg)인 지점에서 나타난다고 알려져 있다. 본 반응에서의 이탈기의 염기도는 ～10정도이며 가장 염기도가 큰 피페리딘의 pK_a 값이 11.2인 점으로 보아 본 연구의 반응계에서 rds는 모두 제거단계(k_2)임을 예측할 수 있다. 반응 결과 관측된 아래로 휘어지는 곡선에서 포화되는 지점으로부터 k2 값을 예측 할 수 있었다. Jencks는 이탈기가 떨어지는 단계의 속도상수 k_2 값은 공격하는 아민의 종류나 염기도에 무관하고 기질의 구조와 이탈기의 염기도에만 의존하다고 주장하였다. 그러나, 연구결과 염기도가 작은 아민에 대한 k_2 값은 염기도가 큰 아민에 대한 k_2 값보다 훨씬 작게 나타났다. 이로부터 또 다른 평형단계인 K 을 도입하였다. 그리고 아래로 휘어지는 곡선은 steady state approximation으로는 설명이 불가능해서 본 반응에서는 improved steady state approximation을 도입해서 유사일차 반응속도식을 유도하였고, 유도한 식으로부터 반응중간체가 생성물로 분해되는 단계의 반응속도상수 k_2 값을 구하였다. 실험결과로부터 계산되어진 k_2 값과 유도한 식을 이용하여 nonlinear regression method로부터 반응에 포함된 모든 microconstant 값들을 구할 수 있었다. kinetic 결과와 유도한 반응식과 계산된 반응속도상수값들은 좋은 상관관계를 보였다. 각각의 microconstant 값들을 아민의 염기도와 상관지은 Bronsted 형태의 그림은 모두 좋은 직선관계를 보였고, k_1, k_-1, K, K 에 대한 Bronsted β 값은 각각 0.35, -0.16, 0.55, -1.37이었다. 또한, 이와 같이 좋은 직선 관계를 보이는 것은 계산되어진 반응 속도상수 값들이 믿을 수 있는 값들임을 의미한다. 따라서 본 반응은 빠른 속도로 중간 생성물을 생성한 후 이 중간체로부터 느린 반응 속도로 최종 반응생성물이 생성되는 첨가-제거 메카니즘으로 반응이 진행한다고 결론 지을 수 있다. 한편, 25℃ absolute ethanol 용매계에서 dibenzo[1,2]oxahiin 6-oxide와 E_tON_a의 친핵성 치환반응을 분광학적으로 연구하였다. 본 반응계에서 UV spectra는 두 개의 다른 형태를 보인다. 즉, 빠른 반응에 대한 UV spectra와 느린 반응에 대한 UV spectra가 다르게 나타나며 중간 생성물이 생성되는 단계가 UV spectra 상에서 관찰되어진다. 빠른 반응에서 유사일차 반응속도상수와 아민의 농도를 상관지은 그래프는 좋은 직선을 나타내며 이 직선의 기울기와 절편으로부터 정반응 속도상수 k_1과 역반응 속도상수 k_-1을 구할 수 있었다. 느린 반응에서 유사일차 반응속도상수와 E_tON_a의 농도를 상관지은 그래프는 아래로 휘는 곡선을 나타내는데 재현성에 문제점이 있어 앞으로 계속적인 연구가 수행되어져야 하겠다. 결론적으로 본 반응계에서는 기질에 친핵체가 빠른 속도로 공격하여 중간생성물을 형성하고 이 중간생성물로부터 느린속도로 이탈기가 떨어져서 최종 생성물이 형성되는 메카니즘으로 반응이 진행한다. ; First-order rate constants (k_obs) have been measured spectrophotometrically for the reaction of a dibenzo[1,2]oxathiin 6-oxide(1) with a series of alicyclic secondary amines in water and with sodium ethoxide in absolute ethanol at 25.0±0.1℃. UV-Vis and stopped-flow techniques have revealed that the above reaction proceeds via an addition-elimination mechanism with a stable addition intermediate, i.e., the rate of formation of an addition intermediate appears to be much faster than that of the breakdown of the intermediate to the products. For the reaction of dibenzo[1,2]oxathiin 6-oxide with a series of alicyclic secondary amines, the plot of kobs vs amine concentration shows downward curvatures as the amine concentration increases for all the amines studied. Such a downward curvature has never been observed previously for aminolysis of esters and clearly suggests that the present reaction proceeds via an intermediate, and can be used as evidence of a stepwise reaction mechanism. A rate equation fitted to the kinetic results has been derived, and all the microconstants involved for the aminolysis have been calculated from a nonlinear regression method. The resulting Bronsted-type plots are all linear, indicating that the values of these microconstants are reliable. For the fast step reaction of dibenzo[1,2]oxathiin 6-oxide with sodium ethoxide, the plot of kobs vs [E_tON_a] shows good linearity with a positive intercept. A rate equation has been derived to explain the kinetic data. The values of k_1 and k_-1 has been calculated from the slope and intercept of the plot of kobs vs [E_tON_a]. The slow step reaction (decomposition of the intermediate into the products) is identical to that of dibenzo[1,2]oxathiin 6-oxide with secondary amines. Using the derived rate equation, k_1, k_-1, and k_2 values have been calculated.논문개요 = 1 Ⅰ. 서론 = 3 Ⅱ. 실험 = 7 Ⅱ-1. 반응물질의 합성, 정제 및 용매제조 = 7 Ⅱ-1-1. 기질 = 7 Ⅱ-1-2. 친핵체 = 7 Ⅱ-1-3. 반응용매 = 8 Ⅱ-1-4. 반응생성물의 합성 = 8 Ⅱ-2. 반응 속도상수 측정 = 9 Ⅱ-2-1. 반응 속도상수 측정기기 = 9 Ⅱ-2-2. 반응 속도상수 측정방법 = 9 Ⅲ. 결과 및 고찰 = 11 Ⅲ-1. Cyclic sulfinate ester의 aminolysis 반응결과 = 11 Ⅲ-2. 반응 메카니즘과 속도식 = 24 Ⅲ-3. Microconstants = 30 Ⅲ-3-1. k2 값의 추정 = 30 Ⅲ-3-2. Dibenzo[1,2]oxathiin 6-oxide와 2차 아민 반응에서의 microconstants = 38 Ⅲ-4. 아민의 염기도와 반응성의 관계 = 47 Ⅲ-4-1. 아민의 염기도에 대한 통계학적 보정 = 47 Ⅲ-4-2. Microconstants와의 관계 = 48 Ⅲ-4-3. 평형상수와의 관계 = 49 Ⅲ-5. Cyclic sulfinate ester(1)와 sodium ethoxide의 반응 = 54 Ⅲ-5-1. 반응 메카니즘과 속도식 = 59 Ⅲ-5-2. Cyclic sulfinate ester(1)과 sodium ethoxide 반응에서의 용매효과 = 62 Ⅳ. 결론 = 67 Ⅴ. 참고문헌 = 68 영문초록 = 70 부록 = 7

A Study on the Newly Choreographed Work 「THE RED」 Based on Franz Kafka's『Die Verwandlung』

Modern society which change too fast bring the material affluence with development of science technique and media, but in inside, cause more big problem that spiritual poverty. People can not follow the speed of society development and was died out in society, were treated as a machine, was ignored inherent individuality and personality. Therefore people are increasing who feel psychological sense of isolation that loss and loneliness, anxiety about existence and left out, if these go wrong, we have come to an extreme situation of human alienation that lossing themselves and inherent individuality. According to this, people, for lead better healthy life mentally, must establish the essential value of existence of individual, getting out alienation phenomenon and recognizing the lacking existence of own. So I tried to new understanding the importance of human existence that in society, person have independent sight and show individual uniqueness with own voice and not a person as a mean but as having finality and realize the self of true meaning, finding value and mean of independent life. So the researcher choreographed with a human alienation that dealing in creative dance work「THE RED」novel of Franz Kafka, Die Verwandlung. I form total 3 page, based on content that overcoming, isolation, real self that was shown by fictional character, Gregor, who become be alienated from the family and society. This work made with topic that delivering the important of free life and realizing their exist as an exist human getting out the human alienation and by doing so that show the human figure who overcome from the alienation, realizing the existence value by self through work and recovering the independence, and I tried to show the bright human figure who living with independent determination. For this, I analysis the work, concentrating on topic and content, according to the scene stage configuration, migratory routes and movement of dancer, clothes and imagine of lighting. First chapter show human figure of anxiety who was isolated by the society domination and was alienated. To express these content, in alienate space as a center of stage where limit the space, be concentrated most, I use the top light which make the anxious and tension that red boundary. Also in center of stage space, I accent the merit of anxious of human who feel alienate with a image of alienate like a locked through the passive movement of low posture without the way of movement. I tried to mean the clothes as a bridle of society using a red long cloth which mean the warning and taboo, and show the painful human figure effectively, winding up neck of dancer with cloth like choking. Chapter two show the change of human psychology which was maximized, starting resistance to overcome alienation. According to dancer move to out of stage, divide the space of alienation fairly, not lean any side of sewerage and top water, I tried to switch of scene, extending to center of stage which space of resistance which variable and widespread and control whole stage and I light rectangle figure to expanded space. And in way light of narrow rectangle, I tried to show overcoming process by in stages, expanding a light by in stages with big circle which was composed of small circle. Also dancer in resistance space show human figure which be free and maximized human psychology which willing to against the alienation through floating moving route and expanded movement which mainly have speed of stiring hand and application that stiring and scattering the red clothes repeatedly. With use of clothes, make overcoming will as a visualization they show the human figure highlight who desires to free. Chapter 3 tried to deliver message of hopeful human figure to find real self through humanity recovery, overcoming alienation completely. Stage space use the 'space of hope' that diagonal line that extend toward in front of under water that close to audience, in this spaces, we tried to show positive human figure that living independent life through overcoming alienation with movement that step forward slowly and dancer see confidently with high sight according to straight moving route. And in chapter 3, dancer put off the red cloth completely, this tried to visualize human figure who was be freed because of overcoming alienation. Also I tried to highlight confident human figure who recovered independence through shining with way light in 'space of hope', in last scene, I tried at the same time to highlight the topic and deliver the hopeful end using a red light which means the passion. Therefore,「THE RED」express phenomenon of human alienation that people undergo and figure that overcome this. Researcher, through the work, has meaning of research that people who was isolated as a mentally and lost themselves realize value of existence of themselves, overcoming human alienation, and find the mean and value of life with mental health, recovering the identity of true mean as a natural figure of me, suggest that each of us must live an independent life as a host of society.;빠르게 변화하는 현대사회는 과학기술과 매체의 발달로 물질적 풍요를 가져왔으나 그 이면에는 정식적 빈곤이라는 더 큰 문제점을 야기하게 되었다. 현대인들은 급격하게 발전하는 사회의 변화속도를 따라가지 못하고 개인의 고유한 개성과 인격을 무시당한 채 기계처럼 취급받게 되면서 사회에서 점점 도태되어져 간다. 따라서 존재에 대한 상실과 외로움, 불안감이라는 심리적 고독감을 느끼고 내적으로 점점 고립되어 소외를 겪는 현대인이 증가하고 있으며 이러한 정서적 결핍이 심각해지면 진실한 ‘나’의 모습을 잃어버리는 인간소외의 극단적 상황에 이르게 된다. 이에 따라 현대인들은 정신적으로 보다 건강한 삶을 영위하기 위해 소외된 자신의 존재를 인지하여 소외현상으로부터 벗어나 개개인의 본질적인 존재가치를 확립하여야 한다. 따라서 사회에서 개인은 자신들의 목소리로 개개인의 고유성을 당당하게 드러내고 스스로의 삶에 목적성을 가진 존재로서 주체적인 삶의 가치와 의미를 모색하여 진정한 의미의 참된 자아를 실현하는 인간 존재의 중요성을 재인식하고자 하였다. 이에 본 연구자는 무용창작작품 「THE RED」(2012)를 프란츠 카프카(Franz Kafka, 1883-1924)의 소설 『변신(Die Verwandlung)』(1916)에서 다루는 인간소외를 소재로 안무하였다. 사회와 가족으로부터 점점 소외되어져가는 소설 속 주인공 그레고르를 통해 나타나는 ‘소외, 저항, 자아 발견’이라는 내용을 기반으로 하여 총 3장으로 구성하였다. 본 작품은 인간소외로부터 벗어나 실존하는 인간으로서 자신의 존재 인식을 통해 진정한 의미의 참된 자아를 발견하여 주체적인 의지로 삶을 실현하는 희망적인 인간의 모습을 전달하는 것을 주제로 창작되었으며, 작품을 통해 소외로부터 극복한 인간의 모습을 보여줌으로써 자신만의 신념과 생각으로 스스로의 삶을 능동적으로 개척해 나가는 모습을 보여주고자 하였다. 이를 위해 본 작품을 주제 및 내용, 장면에 따른 무대구성, 무용수의 이동경로와 움직임, 의상과 조명의 이미지를 중심으로 분석하였다. 1장은 사회로부터 지배당하여 고립되고 소외를 겪는 불안한 인간의 모습을 나타내었다. 이와 같은 내용을 표현하기 위해 가장 집중이 잘되는 무대중심부로 공간을 제한한 ‘소외의 공간’에서 불안과 긴장감을 조성하는 붉은색의 경계가 뚜렷한 탑 조명을 사용하였다. 또한 제한된 무대중심부 공간 안에서 이동경로 없이 낮은 자세의 소극적인 움직임을 통해 갇혀있는 듯한 고립된 이미지로 소외를 겪는 불안한 인간의 정서적 특성을 강조하였다. 의상 또한 경고, 금기를 의미하는 붉은색의 긴 천을 사용하여 사회의 굴레를 상징하고자 하였으며, 천으로 무용수의 목을 조르듯이 감아 고통스러운 인간의 모습을 효과적으로 나타내고자 하였다. 2장은 소외로부터 극복하기 위해 저항하기 시작하면서 극대화된 인간의 심리변화를 나타내었다. 1장에서 제한되었던 ‘소외의 공간’ 인 중앙에서 가변적이고 광범위한 무대주변부로 공간을 확장시켜 상, 하수 어느 공간으로도 치우치지 않게 균등하게 나눈 무대 전체를 모두 아우르는 ‘저항의 공간’으로 장면전환을 시도하였으며, 확장된 공간에 직사각형 모양의 조명을 비추었다. 좁은 직사각형의 길 조명에서 작은 원들로 이루어진 큰 원으로 단계적으로 조명을 확장시켜 극복의지 과정을 단계적으로 나타내고자 하였다. 또한 무용수는 ‘저항의 공간’에서 유동적인 이동경로와 주로 팔을 휘젓는 속도감이 있고 확장된 움직임과 더불어 붉은 천의 의상을 반복적으로 뿌리고 휘두르는 활용을 통해 소외로부터 저항하려는 극대화된 인간의 심리상태와 자유로워진 인간의 모습을 나타내었다. 이러한 의상의 사용으로 극복의지를 시각화하여 자유를 갈망하는 인간의 모습을 부각시켜 나타내었다. 3장은 소외로부터 완전히 극복하여 인간성 회복을 통해 참된 자아를 발견하는 희망적인 인간의 모습을 전달하고자 하였다. 무대 공간은 관객과 가장 가까운 하수 앞쪽으로 뻗어져 나오는 사선의 길인 ‘희망의 공간’을 사용하였는데, 이러한 공간에 길 조명으로 뚜렷하게 비추어 주체성을 회복한 당당한 인간의 모습을 부각시키고자 하였으며, 마지막 장면에 열정을 의미하는 붉은색 조명을 사용하여 희망적인 결말을 전달하는 동시에 주제를 부각시키고자 하였다. 그리고 ‘희망의 공간’에서 직선적인 이동경로에 따라 무용수가 높은 시선으로 당당하게 바라보고, 한발 한발 천천히 걸어 나오는 움직임으로 주체적인 삶을 살아가는 긍정적인 인간의 모습을 뚜렷하게 나타내고자 하였다. 또한 무용수는 3장에서 붉은 천의 의상을 완전히 벗어버리는데, 이는 소외를 극복하여 자유로워진 인간의 모습을 시각화하여 나타내고자 하였다. 따라서 무용창작작품「THE RED」는 현대인이 겪는 인간소외현상과 이를 극복하는 모습을 표현하였다. 이에 본 연구자는 작품을 통하여 사회에서 요구하는 획일화된 틀 속에 자신을 맞춰나가면서 정신적으로 고립되는 현대인이 인간소외로부터 극복하여 스스로의 존재가치를 깨닫고 본연의 ‘나’의 모습으로 정신이 건강한 삶의 가치와 의미를 찾도록 하는데 연구의 의의를 가지며, 무용창작작품「THE RED」를 통해 주체적인 삶을 영위하기 위한 우리의 능동적인 의지는 매우 중요하다는 것을 전달하면서 개개인이 삶의 주인이 되어 자신만의 생각과 신념으로 스스로의 삶을 이끌어 나가고 개척할 수 있어야함을 제시하고자 하였다.Ⅰ. 서론 1 A. 연구의 필요성 및 목적 1 B. 연구의 방법 4 Ⅱ. 이론적 배경 5 A. 실존주의 이해 5 B. 현대사회의 특징과 현대인의 정신적 상황 11 1. 현대사회의 특징 11 2. 인간소외 현상 13 C. 프란츠 카프카의『변신』에 나타난 인간소외 19 1. 프란츠 카프카의 사상적배경 19 2.『변신』의 줄거리 및 장면전개 21 가. 소외 22 나. 저항 23 다. 자아 발견 25 D. 타 예술에서 나타나는 인간소외 27 Ⅲ. 안무의도 30 A. 내용적 측면 30 B. 형식적 측면 32 Ⅳ. 무용창작작품 「THE RED」에 관한 분석 34 A. 주제 및 내용 34 B. 장면에 따른 무대 구성 37 C. 무용수의 이동경로와 움직임 44 D. 의상과 조명의 이미지 66 Ⅴ. 결론 78 참고문헌 81 ABSTRACT 8