Molecular characterization of relaxin and decorin on the degradation of extracellular matrix and induction of apoptosis

의과학과/박사[한글]기존에 McCormick 그룹에 의해 종양세포 특이 증식 및 세포살상 재조합 아데노바이러스에 대한 연구가 처음 보고 된 이후 그 유용성과 안전성이 임상시험에서 확인되었지만, 종양내로 투여된 바이러스가 일부 주변으로만 제한적, 국소적으로 확산되고 종양조직 전체에 퍼지지 못하여 결과적으로 바이러스에 감염되지 않은 종양 세포는 다시 빠르게 성장하여 만족할 만한 치료효과를 얻지 못하였다. 이러한 항종양 치료용 아데노바이러스의 국소적 종양 침투력과 낮은 항종양 효과의 한계를 개선하기 위해 종양 특이적 살상 아데노바이러스에 matrix degradative protein인 relaxin과 decorin 유전자를 각각 도입시킨 아데노바이러스가 제작되어 종양 조직 내 바이러스 확산능의 향상과 암세포 살상 증대 효과를 비교 검증 하는 시도가 이루어졌으며, 이를 통해 relaxin과 decorin을 발현하는 아데노바이러스의 개선된 종양 조직 내 확산능과 우수한 생체 내,외 항종양 효과를 확인되었다. 그러나 relaxin과 decorin과 같은 matrix degradative protein이 어떠한 메커니즘에 의해 종양 조직내 바이러스 확산능을 증가시키고 세포사를 유도하며 세포고사에 의한 암세포 살상 효과를 증가시키는 지에 대한 연구는 아직 미비한 실정이다. 이러한 배경 하에, 본 연구에서는 relaxin과 decorin이 암세포의 세포기질 분해와 세포고사에 작용하는 기전을 정확히 밝히고자 relaxin과 decorin을 발현하는 바이러스를 이용하여 relaxin- 또는 decorin-mediated extracellular matrix(ECM) degradative pathway와 relaxin- 또는 decorin-mediated apoptosis pathway를 규명하였다. 본 연구에서는 decorin과 relaxin을 발현하는 아데노바이러스의 종양 조직 내 확산효율의 증대가 relaxin과 decorin에 의한 metalloproteinase(MMP)1, MMP10 등의 세포외 기질 분해에 관여하는 enzyme의 증가, collagen type I, elastin 그리고 collgen type III와 같은 세포외 기질의 주요 성분의 분해에 의해 촉진됨을 확인하였다. 또한 relaxin과 decorin을 발현하는 아데노바이러스는 tumor growth factor(TGF)-β, epidermal growth factor receptor(EGFR) 그리고 epithelial mesenchymal transition(EMT)의 발현조절을 통해 extracellular metrix(ECM)의 assembly와 생산 그리고 분해 등 여러 단계에서 종양 조직 내 결합조직의 재조합에 중요한 역할을 함으로써 세포외 기질분해와 바이러스 확산능을 증대시키는 중요한 원인으로 작용함을 확인 하였다. 한편, 아데노바이러스에 의해 발현되는 relaxin 또는 decorin이 세포고사의 여러 단계에 관여하여 세포사를 유도하며 특히, relaxin은 inducible nitiric oxide synthase(iNOS)에 의해 촉매되는 nitric oxide(NO)의 생성을 통해 p53-independent pathway로 apoptosis signal을 mitochodria에 전달하고 이렇게 전달된 신호는 세포고사의 마지막 단계까지 관여함이 확인 되었다. 반면, decorin은 p53 dependant apoptosis를 통해 mitochodrial apoptosis protein인 Bax, Bcl2, Cytochrome C에 신호를 전달하여 mitichondria-mediated apoptosis를 유도함을 확인 하였으며, 이렇게 전달된 apoptotoc signal은 세포고사의 마지막 단계에 존재하는 단백질인 Poly (ADP-ribose) polymerase(PARP)까지 전달됨으로써, decorin을 통한 강력한 세포고사가 유도됨을 밝혔다. 또한 decorin은 세포주기를 조절하는 p21의 발현을 촉진시킴으로써 G2/M arrest를 유도할 뿐 아니라 EGFR의 활성을 저해하고 Mitogen-activated protein kinases(MAPK)의 활성을 억제하여 암세포의 증식을 방해함으로써 세포사를 유도함을 확인할 수 있었다. 결론적으로, 본 연구에서는 종양 조직 내로의 바이러스의 확산증진과 강력한 세포고사 유도제로 작용하는 relaxin과 decorin의 새로운 기능을 분자적인 수준에서 규명하여 실제로 아데노바이러스를 전달체로 이용한 유전자 치료에 적용하였고 이는 추후, 여러 종류의 비-바이러스성 유전자 전달체를 이용한 유전자 치료뿐만 아니라 아데노바이러스와 항암제의 병용투여시 치료효과의 증대 목적으로 유용하게 적용될 수 있을 것으로 사료된다. [영문]The pressing challenge for contemporary gene therapy is to deliver an effective level of therapeutic genes to cancer cells throughout at tumor in vivo. The extracellular matrix provides one barrier to adenoviral dispersion in a tumor. To overcome this barrier, we inserted the genes for relaxin and decorin, a protein that degrades the extracellular matrix, into adenoviruses. By using these relaxin and decorin expressing adenoviruses, we have confirmed that relaxin or decorin expression increased the dispersion of the virus from cell to cell within the tumor and the induction of tumor cell apoptosis. However, the mechanism that which relaxin and decorin induces degradation of extracellular matrix and apoptosis is not clearly understood. In this study, we characterize the mechanism of relaxin and decorin on the degradation of extracellular matrix and induction of apoptosis. Relaxin and decorin induce degradation of extracellular metrix by up-reguation of expression of MMP1, MMP10 not by expression of MMP2. Decorin plays a role on decreasing expression of TGF-beta and EGFR which trigger extracellular matrix�degradation and�remodeling function. The expressions of collagen typeI, elastin and collagen typeIII in tumor tissue are significantly decreased by relaxin and decorin. Also, Decorin induces cell death through p53-dependent apoptosis pathway, inhibition of cell proliferaltion and induction of cell cycle arrest. Decorin activates mitochondrial apoptosis and G2M arrest by increased p53 expression. Also decorin inhibits cell proliferation by blocking epitherial growth factor receptor(EGFR) and mitogen-activated protein (MAP) kinases(MAPK) pathway. Also, Relaxin induces nitric oxide(NO)- mediated apoptosis pathway not p53 dependent apoptosis pathway. NO is synthasiezed from arginine and O2 by inducible NO synthase(iNOS). Relaxin activates caspase signaling by NO- induced mitochondrial apoptosis. In summary, our results clearly demonstrated the molecular mechanism of relaxin and decorin on degradation of extracellular metrix and induction of apoptosis and exhibited the potential strategy based on relaxin and decorin expressing oncolytic adenovirus and open new chance for combining the cancer gene therapy.ope

Anti-tumor effect of E1B-mutant replication competent adenovirus combined with chemotherapeutic agent

의과학과/석사[한글] 암에 대한 유전자 치료연구의 최근 경향은 한 가지 특정 유전자를 이용한 치료법의 개발보다는 여러 치료 유전자를 동시에 이용하는 방안, 암세포를 선택적으로 죽일 수 있는 종양 특이 증식 살상 아데노바이러스의 개발, 방사선 또는 항암제 등 기존의 치료방법과 병합 치료하는 방안 등이 활발히 연구되고 있다. 최근의 연구에서는 아데노바이러스 초기 유전자인 E1B 55kDa 유전자가 결손된 아데노바이러스 dl1520 아데노바이러스와 taxol의 병용투여가 암세포 살상에 있어 상승작용을 유도함을 보고한 바 있다. 하지만, 항암제와의 병합치료(combination therapy)에 이용되는 dl1520(ONYX-015)을 포함한 대부분의 아데노바이러스에는 세포고사 억제 기능을 가진 E1B19kDa 유전자가 원상태로 그대로 보존되어 있어 여러 항암제에 의해 유도되는 세포고사를 억제하여 항암 효과를 저해시킬 수 있다. 그러므로 E1B 19kDa 단백질의 기능이 선택적으로 소실된 암세포 특이적 증식 가능 아데노바이러스를 항암제와 함께 병용 치료한다면, 아데노바이러스의 증식에 따른 세포괴사 뿐 아니라 아데노바이러스 또는 항암제에 의해 유도되는 세포고사를 함께 유도할 수 있어, 항종양 효과를 개선시킬 수 있을 것이다. 이러한 배경 하에 본 연구에서는, 아데노바이러스와는 다른 기작으로 작용하여 세포를 살상하는 항암제인 paclitaxel, adriamycin, 5-FU 그리고 cisplatin등을 E1B 55kDa 유전자가 결손된 종양 특이적 살상 아데노바이러스인 Ad-ΔE1B55 또는 E1B 55kDa 과 E1B 19kDa 유전자가 모두 결손된 종양 특이적 살상 아데노바이러스인 Ad-ΔE1B19/55와 함께 병용 투여함으로써 암세포 살상능의 변화 및 병용치료에 따른 상승효과를 규명하고자 하였다. 이에, 본 연구에서는 복제 가능 아데노바이러스의 세포 살상능을 비교 검증할 수 있는 CPE assay와 MTT assay를 통하여 Ad-ΔE1B55에 비해 Ad-ΔE1B19/55에 의한 세포 살상능이 우수함을 확인할 수 있었다. 또한, 아데노바이러스만을 단독 처리했을 때에 비해 아데노바이러스와 항암제를 병용 투여한 경우의 암세포 살상능이 월등히 우수함을 확인할 수 있었다. 특히 E1B 19kDa 유전자가 결손된 Ad-ΔE1B19/55 아데노바이러스와 항암제를 병용 투여한 경우의 암세포 살상능이 E1B 19kDa 유전자가 존재하는 Ad-ΔE1B55와 항암제를 병용 투여한 경우보다 월등히 증가하였다. 이러한 Ad-ΔE1B19/55와 항암제의 병용투여에 의한 암세포 살상능의 상승작용은 생체내 항종양 실험에서도 확인되었다. 결론적으로, 이들 결과들은 E1B 19kDa의 기능이 선택적으로 소실된 암세포 특이적 살상 아데노바이러스와 항암제의 병용 치료를 통하여 아데노바이러스의 증식에 따른 세포괴사 뿐 아니라 아데노바이러스 또는 항암제에 의해 유도되는 세포고사를 함께 유도할 수 있어, 항종양 효과를 더욱 개선시킬 수 있음을 의미한다. 이는 결과적으로 증식 가능 아데노바이러스와 항암제의 병용치료법의 임상적 유용성을 확립하여 암유전자 치료에 진일보된 방안으로 제시될 수 있을 것으로 기대된다. [영문]Gene attenuated replication competent adenoviruses are being developed as novel anti-tumor therapeutics. Clinical trials with the ?E1B55 (E1B 55kDa-deleted) adenovirus in combination with a chemotherapeutic agent, taxol, have demonstrated a synergistically lethal effect. All replicating adenoviruses used in combination therapy have their E1B19 gene in tact. Because the E1B19 protein is an anti-apoptotic agent, adenoviruses retaining their E1B19 gene may cause a possible anti-apoptotic effect contrary to the apoptotic effect of taxol diminishing the overall potency of the combinatorial therapy. In this study, we investigated the possibility of enhanced oncolytic and replication ability of combining E1B19-mutant adenoviruses (Ad-?E1B19/55) with taxol. In such a strategy, cell death caused by the E1B19-mutant adenoviruses and the apoptotic effect caused by taxol will combine for an overall synergy effect in killing cancer cells. The in vitro efficacy of adenovirus and taxol has been evaluated by the CPE assay and MTT assay. Our results show that the degree of cytopathic effect of Ad-ΔE1B19/55 was higher than that of Ad-ΔE1B55. Furthermore, compared with a virus-only treatment, an enhanced cytopathic effect was shown when the two factors were applied together. Our results from PI staining and TUNEL assay also demonstrated that the Ad-ΔE1B19/55 infected cells or taxol treated cells cause greater induction of apoptosis compared to Ad-ΔE1B55 infected cells or virus-only infected cells. The synergy effect of this combinatorial therapy has also been verified through an in vivo study. Taken together, the E1B19kDa-deleted (Ad-ΔE1B19/55) replication competent adenovirus may serve as an enhanced vector for anti-cancer gene therapy, especially when applied in combination with apoptotic chemotherapeutic agents such as taxolope

Coxsackie and adenovirus receptor binding ablation reduces adenovirus liver tropism and toxicity

Human adenovirus-based vectors have emerged as a new promising vehicle for in vivo gene transfer-mediated therapy. However, the full potential of this methodology has not been fully realized because of the nonspecific tissue distribution of adenoviral vectors. Adenovirus infection is initiated by forming a complex between the fiber protein and a ubiquitously expressed host cell membrane protein, coxsackie B virus and adenovirus receptor (CAR). Therefore, ablating the adenovirus vector's ability to bind to the CAR is the first step in redirecting adenoviral tropism. To ablate CAR binding, we mutated the Bbeta sheet of the fiber knob, generating CAR-binding ablated replication-incompetent (dl-K420A-Z) and replication-competent (YKLK420A) adenoviral vectors. The in vitro transduction efficiency of dl-K420A-Z was significantly reduced in comparison to dl-LacZ carrying the wild-type fiber in CAR-positive cells but not in CAR-negative cells, suggesting that the mutation introduced in the Bbeta sheet of the fiber knob could disable the CAR-dependent transduction pathway. The in vivo transduction was also dramatically reduced in the liver and other organs for mice treated with dl-K420A-Z, compared with a cognate control vector, dl-LacZ. Concomitant with this attenuated gene transfer efficiency in vivo was a substantial reduction in the amount of general toxicity observed in the YKL-K420A-treated mice. Diminished toxicity was surmised from quantitative measurement of serum level of enzymes for liver and kidney function, hematologic chemistries, histopathology, and differences in lethality. Significant decrease in serum transaminases (alanine transferase [ALT] and aspartate transferase [AST]) was observed in mice treated with YKL-K420A. In addition, the lethality was lower in the YKLK420A- treated groups compared to the YKL-1-treated groups at all doses examined. Furthermore, the hepatopathologic analysis revealed that YKL-1 induced focal zonal necrosis and hepatocyte degeneration, while YKL-K420A induced mild spotty necrosis. In summary, this decreased vector tropism of CAR-binding ablated adenoviruses in normal tissues may increase the amount of virus available for infecting tumor cells and thus increase the antitumor efficacy with fewer unwanted side effects.restrictio