냄새의 시각화를 위한 세포 및 단백질 기반의 광학적 냄새분자 측정 방법 개발

학위논문 (박사)-- 서울대학교 대학원 : 협동과정 생물화학공학전공, 2014. 8. 박태현.인간의 후각 시스템은 수천 가지의 냄새물질을 매우 낮은 농도까지 감지 및 구별할 수 있다. 냄새의 감지는 비강 후면의 후각 상피에 다수 포진하는 섬모 표면의 후각 수용체가 냄새 물질을 인지하는 데서 시작된다. 인간의 후각 수용체는 390여 가지에 달하며, 하나의 후각 신경세포가 하나의 후각 수용체를 발현하는 것으로 알려져 있다. 후각 수용체가 냄새분자와 결합하면 후각 수용체의 구조 변화가 일어나고, 여기서 비롯된 세포 내 신호 전달 기작에 의해 발생한 전기생리학적 신호가 뇌로 전달된다. 한 가지의 후각 수용체 단백질은 여러 종류의 냄새분자와 결합할 수 있고, 또한 한 가지의 냄새 분자는 여러 가지의 후각 수용체와 결합할 수 있는데, 인간은 후각 수용체와 냄새 분자간의 다양한 결합 패턴을 통하여 냄새를 구별하게 된다. 따라서 후각 수용체와 냄새 분자의 결합 패턴에 관련된 데이터 확보는 인간이 냄새를 인지하는 방식을 이해하기 위해 매우 중요하다. 후각 수용체의 기능을 밝히기 위해 전 세계의 많은 연구자들이 칼슘 이미징 및 CRE 리포터 어세이 등 인공 후각세포 기반의 스크리닝 시스템을 개발해 왔다. 하지만 많은 단계를 거쳐야 하는 스크리닝 실험의 특성상 대부분의 후각 수용체의 기능은 여전히 밝혀지지 않고 있는 상태이다. 본 연구에서는 후각 수용체와 냄새 분자간의 결합을 광학적 측정기술을 활용하여 시각화함으로써 후각 수용체의 기능 및 냄새물질과의 반응 패턴을 분석하는 시스템을 개발하였다. 후각 수용체 단백질이 포함된 인공 후각세포를 냄새 측정 시스템의 1차 변환기로 활용하였고, 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 장비, 형광 현미경, 형광 이미지 스캐너 등을 2차 변환기로 활용하였다. 후각 수용체 단백질은 대장균 발현 시스템을 통해 대량으로 확보하였고, 정제 및 리폴딩 과정을 거쳐 SPR 기반의 냄새 측정 시스템에서 1차 변환기로 이용하였다. 또한 고속 대량 스크리닝 시스템 및 냄새 측정 시스템의 시각화를 위하여 인공 후각세포를 소자로 활용하였다. 소형화된 플랫폼을 제작하기 위하여 Polyethylene glycol (PEG) 마이크로웰을 제작하였고, 역 형질주입 기술을 도입하여 다양한 후각 수용체를 마이크로웰 상에서 동시에 발현시킴으로써 고속 대량 스크리닝이 가능하도록 하였다. 또한 세포 내 신호 전달 기작을 조작하여 냄새 분자가 후각 수용체에 결합하면 녹색 형광 단백질이 발현되어 형광현미경으로 측정 가능하도록 함으로써 냄새 반응을 시각화하였다. 기존에 널리 이용되어 온 칼슘 이미징 방법은 후각 수용체를 한 종류씩 세포에서 발현시켜야 하고 칼슘 측정용 염색약을 세포 내에 주입하여 냄새를 측정하기 때문에 대량 스크리닝이 용이하지 않았던 반면, 본 연구는 다양한 후각 수용체의 동시 발현 및 형광 단백질을 활용한 시각화로 인해 안정적인 냄새 측정 및 고속 대량 스크리닝이 가능하다는 장점이 있다. 하지만, 형광 단백질을 통해 냄새 측정이 이루어지기 때문에 단백질 발현 시간이 소요된다는 단점이 있는데, 이를 극복하기 위하여 후각 수용체의 구조 변화를 이용하여 실시간으로 냄새를 측정 및시각화하는 연구를 진행하였다. 실시간으로 냄새를 측정하기 위하여, 후각 수용체와 칼륨 이온 채널을 연결하여 후각 수용체가 냄새 분자와 결합했을 때 발생하는 구조적 변화로 인해 칼륨 이온 채널이 물리적으로 열리도록 하였다. 열린 칼륨 이온 채널을 통해 유입된 칼륨 이온을 막전위 측정용 염색약를 이용하여 측정함으로써 실시간 이미징이 가능하게 되었다. 이온 채널이 연결된 후각 수용체를 냄새 측정 시스템의 소자로 활용하게 되면 세포 내 신호 전달 기작에만 의존하던 기존 연구 방식으로부터 벗어나 후각 수용체의 구조적 변화를 이용할 수 있기 때문에, 세포의 상태가 야기하는 불안정성으로부터 자유로울 수 있다. 본 연구에서는 여러 후각 수용체 단백질들을 이온채널과 연결하여 냄새를 실시간으로 측정하고 이미징하는 냄새 측정 시스템을 개발함으로써 다양한 냄새의 패턴을 시각화하였다. 냄새 측정 시스템의 광범위한 활용을 위해서는 기체 상태의 냄새 물질을 측정하는 것이 중요하다. 따라서 본 연구에서는 마이크로 플루이딕 시스템과 polycarbonate (PC) 멤브레인을 활용하여 기체 상태의 냄새 분자와 후각 수용체의 반응을 시각화하는 연구를 수행하였다. PC 멤브레인에 인공 후각세포를 배양하여 마이크로 플루이딕 시스템에 거꾸로 삽입한 후, 멤브레인 상부에 기체상태의 냄새분자를 주입함으로써 멤브레인을 통과한 냄새 분자가 후각 수용체와 결합하여 신호를 발생시키도록 설계하였으며, 발생된 신호는 칼슘 이미징을 통해 시각화하였다. 본 연구에서는 후각 수용체와 냄새 분자의 결합 패턴을 다양한 플랫폼과 측정 기법을 활용하여 시각화하였고, 고속 대량 스크리닝 시스템 및 패턴 분석 도구로써의 활용 가능성을 제시하였다. 냄새 반응의 시각화 기술은 인간이 인지하는 냄새의 패턴을 제시할 수 있으며, 냄새에 코드를 부여하여 표준화하는 연구에 활용될 것으로 기대한다.Human olfactory system can detect and discriminate numerous odorant molecules with high sensitivity and selectivity using olfactory receptor (OR). Human has about 390 ORs and each OR can bind to various odorant with different affinity and one odorant molecule can also bind to various ORs. The smell is recognized through the various combination of bindings between OR and odorants. Many researchers have developed highly efficient odorant detection system by mimicking natural olfactory system. The artificial olfactory cells or OR protein have been used as a sensing material. However, up to now, only few ORs have been characterized because of the lack of effective screening tool. Thus the characterization of many orphaned ORs via new high-throughput system and the pattern analysis of odorant responses are inevitable for further applications of ORs. In this thesis, the function of ORs and their response patterns in the presence of various compounds were analyzed visually via various optical analysis systems. Using ORs and artificial olfactory cells as sensing material, the odorant binding event or the cellular response upon odorant stimulation was detected and visualized. The ORs, which were expressed in E. coli system with large quantity, were used as effective sensing materials in surface plasmon resonance (SPR)-based system after the purification and refolding steps. And for the high-throughput screening and visualization of various odorant responses, the artificial olfactory cells were used as sensing materials. The polyethlyenglycol (PEG) microwell was constructed as a miniaturized screening platform, and various ORs were expressed on the microwell using reverse transfection technique. The odorant response was visualized by CRE reporter assay system which expresses fluorescence protein as a reporter. The conventional odorant screening system has a limitation for high-throughput format because of the complicated experimental steps, while the PEG microwell-based system combined with a reverse transfection technique has advantagesvarious ORs can be expressed simultaneously and the imaging odorant response is stable and effective. However, this system requires a time for protein expression, thus a different approach to immediately detect and visualize the odorant response was also conducted. For the real time detection and visualization of odorant response, ORs were linked to the potassium ion channel. The conformational change of OR by the odorant binding induces the ion channel physically opened. The odorant response was immediately visualized using membrane potential dye by detecting the potassium influx through the ion channel. In this study, various ORs were coupled to the ion channel for the visualization of various odorant response patterns. The odorant detection using ion channel-coupled OR was majorly dependent on the conformational change of the physically linked-protein rather than intracellular transduction pathway. Based on this mechanism, it was demonstrated that the ion channel-coupled OR can be used as an effective protein-based odorant detection material for the real time visualization of odorant response. Natural olfactory system detects the odorant in gaseous phase, thus, in this study, the detection of gaseous odorant is very important. In this study, the detection and visualization system of gaseous odorant was also developed using polycarbonate (PC) membrane and the microfluidic system. The OR-expressing cells were cultured on the PC membrane and placed in the PDMS chamber in the inverted format. Then the gaseous odorant was injected in the upper side of the chamber so that the cells could be exposed to the gas through the pores of the membrane. The odorant response was visualized using calcium imaging method. The visualized odorant response can be used as a code for smell. The visualized patterns of smell can be used not only for understanding human olfactory system but also for various purposes in medical and industrial applications. This study offers various protein- and cell-based optical methods for the visualization of smell in high-throughput screening platform.Contents Chapter 1. Research Background and Objective Chapter 2. Literature review 2.1 Olfaction 2. 1. 1 Olfactory system 2. 1. 2 Olfactory receptor and signal transduction 2. 2. Odorant screening system 2. 2. 1. cAMP assay 2. 2. 2. Calcium imaging 2. 2. 3. CRE reporter assay system 2. 2. 4. Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) assay 2. 3. Bioelectronic nose 2. 3. 1. Quartz crystal microbalance 2. 3. 2. Surface plasmon resonance 2. 3. 3. Microelectrode 2. 3. 4. Field effect transistor 2. 4. Visualizaton of smell Chapter 3. Experimental procedures 3. 1. Molecular cloning 3. 1. 1. Cloning of hOR genes 3. 1. 2. Construction of plasmid containing CRE reporter system 3. 1. 3. Construction of ion channel-coupled hORs 3. 2. Expression of hORs 3. 2. 1. Expression of hOR in E. coli system 3. 2. 2. Expression of hOR in mammalian cell system 3. 2. 2. 1. Electrophoration 3. 2. 2. 2. Lipofectamine 3. 2. 2. 3. Reverse transfection 3. 2. 3. Confirmation of the expression of hOR 3. 2. 3. 1. Western blot analysis 3. 2. 3. 2. Immunocytochemistry 3. 3. Reconstitution of hOR 3. 3. 1. Purification of hOR from E. coli 3. 3. 2. Reconstitution of hOR using liposome 3. 3. 3. Confirmation of reconstituted hOR 3. 3. 4. Size control of liposome containing hOR3A1 3. 4. PEG microwell-based odorant screening system 3. 4. 1. PDMS stamp fabrication 3. 4. 2. PEG microwell fabrication 3. 5. Fabrication of microfluidic system for odorant detection in gas phase 3. 5. 1. Design and assembly of a microfluidic system for odorant detection in the gas phase 3. 5. 2. Cell adhesion on the polycarbonate membrane 3. 5. 3. Preparation of gaseous odorant 3. 6. Detection of odorant response 3. 6. 1. SPR analysis 3. 6. 2. CRE reporter assay 3. 6. 3. Membrane potential assay 3. 6. 4. Calcium imaging 3. 6. 5 Image analysis 3. 7. Reagent Chapter 4. SPR-based odorant detection using liposome containing olfactory receptor 4. 1. Introduction 4. 2. Optimization to form the liposome containing hOR3A1 4. 3. Confirmation and size control of the liposome containing hOR3A1 4. 4. Adsorption of the liposome containing hOR3A1 onto the surface of SPR 4. 5. Odorant binding activity test of the reconstituted hOR3A1 immobilized on the SPR gold surface 4. 6. Selectivity of the reconstituted hOR3A1 4. 7. Conclusions Chapter 5. Optimization of the odorant detection system using CRE reporter system 5. 1. Introduction 5. 2. Optimization of CRE reporter system 5. 3. Construction of the HEK293-12CRE stable cell line 5. 4. Fabrication of the PEG microwells 5. 5. Cell adhesion on the PEG microwell 5. 6. Cellular activity in the expression of reporter protein on the PEG microwell 5. 7. Conclusions Chapter 6. Development of high-throughput odorant detection system on the PEG microwell 6. 1. Introduction 6. 2. Expression of hOR on PEG microwell 6. 2. 1. Optimization of reverse transfection 6. 2. 2. Expression of hOR on the PEG microwell using reverse transfection technique 6. 3. Enhancement of OR membrane expression on PEG microwells using RTP1S 6. 4. Odorant screening by visualization using the CRE reporter system on PEG microwells 6. 5. Dose-dependent response 6. 6. Conclusions Chapter 7. Ion channel-coupled OR for real time visualization of odorant response 7. 1. Introduction 7. 2. Construction of the ion channel-coupled hOR 7. 3. Expression of ion channel-coupled hOR 7. 4. Functional analysis of the ion channel-coupled hOR 7. 5. Visualization of odorant response using fluorescence image scanning 7. 6. Visualized response image to various odorants 7. 7. Visualized response of various hOR-Ks to various odorants 7. 8 Conclusions Chapter 8. Visualization of odorant response in gas phase using microfluidic system 8. 1. Introduction 8. 2. Cell adhesion on the polycarbonate membrane 8. 3. Time-dependent response of cells to gaseous odorant 8. 4. Dose-dependent response 8. 5. Selectivity test 8. 6. Conclusions Chapter 9. Overall discussion and further suggestion Bibliography AbstractDocto